本文關(guān)鍵詞：西藏野生大麥耐旱特異蛋白與相關(guān)基因鑒定及外源甜菜堿緩解大麥干旱脅迫生理機(jī)理的研究

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【摘要】：干旱是全球范圍內(nèi)限制作物產(chǎn)量最主要的氣象災(zāi)害。培育抗旱作物品種是提高干旱脅迫下作物產(chǎn)量經(jīng)濟(jì)有效的途徑；發(fā)掘特異抗/耐旱種質(zhì),明確其耐性機(jī)制是培育耐旱新品種和制定耐旱調(diào)控措施的基礎(chǔ)。青藏高原一年生野生大麥(以下簡(jiǎn)稱西藏野生大麥)蘊(yùn)藏著多種抗逆特異基因,為大麥遺傳改良提供了有效的基因庫(kù)。本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的耐旱性不同的西藏野生大麥基因型(Hordeum vulgare subsp. spontaneum)為材料,比較分析干旱脅迫下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的基因型差異,鑒定野生大麥耐旱相關(guān)的目標(biāo)蛋白,克隆耐旱相關(guān)基因,從分子水平上探討野生大麥耐旱機(jī)制。同時(shí),探討了外源甜菜堿對(duì)干旱脅迫下大麥的緩解效應(yīng)及生理機(jī)制,為作物耐旱育種與生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下： 1.干旱脅迫對(duì)西藏野生大麥蛋白表達(dá)譜的影響及基因型差異 以耐旱西藏野生大麥基因型XZ5及干旱敏感基因型XZ54為材料,以栽培品種浙農(nóng)大3號(hào)為對(duì)照,盆栽干旱脅迫試驗(yàn),設(shè)兩個(gè)處理：對(duì)照,在整個(gè)過程中正常澆水,保持土壤含水量30-40%；干旱脅迫,2葉期開始停止?jié)菜?0d至土壤含水量下降到4%,復(fù)水并保持正常水分供應(yīng)5d。干旱脅迫后分別在土壤含水量達(dá)10%(SMC10)、4%(SMC4)及復(fù)水后2d(R1)和5d(R2)時(shí)取植株葉片,利用雙向電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù),分析比較干旱脅迫前后的蛋白質(zhì)表達(dá)譜及其基因型差異,分離鑒定耐旱相關(guān)特異蛋白。結(jié)果表明,雙向電泳技術(shù)每張膠成功分離到1700多個(gè)蛋白點(diǎn),鑒定到基因型差異表達(dá)的與XZ5耐旱相關(guān)的蛋白點(diǎn)38個(gè),質(zhì)譜鑒定和生物信息分析結(jié)果顯示,上述XZ5耐旱相關(guān)的蛋白分別屬于光合作用、逆境脅迫反應(yīng)、新陳代謝、能量和氨基酸生物合成,包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基(rbcL, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)和m型硫氧化還原蛋白(Trx-M, Thioredoxin M, chloroplast precursor)。其中,6個(gè)蛋白點(diǎn)在XZ5特異上調(diào)表達(dá),包括黑色素瘤相關(guān)抗原p7(melanoma-associated antigen p97)、I型葉綠素a/b結(jié)合蛋白b (type Ⅰ chlorophyll a/b-binding protein b)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶1(glutathione S-transferase1)和二磷酸核酮糖羧化酶大亞基(ribulosebisphosphate carboxylase large chain),其中的I型葉綠素a/b結(jié)合蛋白b僅在XZ5中特異表達(dá)(XZ54和浙農(nóng)大3號(hào)中均沒有檢測(cè)到這個(gè)蛋白點(diǎn))。說明這些蛋白可能與耐旱基因型XZ5耐旱性緊密相關(guān)。 2.西藏野生大麥不同基因型rbcL與Trx-M干旱響應(yīng)基因CDS克隆及序列分析 利用簡(jiǎn)并PCR技術(shù)從XZ5、XZ54及浙農(nóng)大3號(hào)大麥基因型葉片中分離rbcL和Trx-M基因編碼區(qū)序列,分別為1401bp(部分CDS區(qū)序列)和528bp(全部CDS區(qū)序列)兩個(gè)基因分別編碼467和176個(gè)氨基酸,均無內(nèi)含子。且該基因核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列與小麥、水稻、玉米、甘蔗及大豆等植物具有較高的同源性。經(jīng)序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)rbcL基因核苷酸序列在XZ5和XZ54中存在差異,在編碼區(qū)序列存在5個(gè)SNPs (single nucleotide polymorphism),其中的2個(gè)SNPs為錯(cuò)義突變。另外,Trx-M基因核苷酸序列在XZ5、 XZ54和浙農(nóng)大3號(hào)中存在差異,在保守結(jié)構(gòu)域中有3個(gè)SNPs,均為錯(cuò)義突變,說明這些錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異,從而可能影響其功能。采用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)工具分析rbcL和Trx-M基因的理化特性,結(jié)果表明這兩個(gè)基因所編碼的氨基酸序列的蛋白分子量分別為5.17和1.92KDa,等電點(diǎn)分別為6.44和8.57。經(jīng)SignalP軟件預(yù)測(cè)出這兩個(gè)基因均不含信號(hào)肽,為非分泌型蛋白。利用NCBI-BLASTP檢索大麥rbcL和Trχ-M基因編碼氨基酸序列同源的物種,并通過ClustalX軟件對(duì)其進(jìn)行多重序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因其進(jìn)化過程中有較強(qiáng)的保守性。進(jìn)一步通過ANTHEPROT軟件完整預(yù)測(cè)出rbcL和Trx-M的二級(jí)結(jié)構(gòu)：rbcL二級(jí)結(jié)構(gòu)為α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲分別占37%、19%、24%、20%；Trx-M二級(jí)結(jié)構(gòu)為α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲分別占31%、29%、26%、14%。通過在線Phyre2預(yù)測(cè)出rbcL和Trx-M的三級(jí)結(jié)構(gòu)。此外,SMART (http://smart. embl-heidelberg.de/)在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)rbcL和Trx-M的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)rbcL蛋白含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；21～146bp大麥不同基因型XZ5、 XZ54和浙農(nóng)大3號(hào))區(qū)間為RuBisco large N結(jié)構(gòu)域；154-462bp (XZ5),154～433(XZ54)和154-462(浙農(nóng)大3號(hào))區(qū)間為RuBisco large結(jié)構(gòu)域。推測(cè)其功能是在RuBisco羧化酶的活性及對(duì)鎂離子綁定方面發(fā)揮作用。其中69-172(大麥不同基因型XZ5、 XZ54和浙農(nóng)大3號(hào))區(qū)間為Trx-M結(jié)構(gòu)域。 3.外源甜菜堿對(duì)大麥干旱脅迫的緩解效應(yīng) 以大麥品種浙大9號(hào)為材料,水培20%PEG6000模擬干旱脅迫試驗(yàn),設(shè)4個(gè)處理：對(duì)照(基本培養(yǎng)液BNS)、 Betaine (BNS+(?)十片噴施5OOμM Betaine)、 Drought (BNS+20%PEG6000)、 Drought+Betaine (BNS+葉片噴施5OOμM Betaine+20%PEG6000),研究外源甜菜堿對(duì)干旱所致大麥損傷的緩解作用。結(jié)果表明,20%PEG6000模擬干旱肋迫環(huán)境下,葉面噴施甜菜堿(Drought+Betaine)能顯著緩解干旱對(duì)大麥幼苗的損害,株高、根長(zhǎng)及生物量都比單獨(dú)PEG干旱脅迫有顯著提高。外源甜菜堿顯著影響細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及活性氧代謝,顯著緩解干旱脅迫引起的葉綠體和根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害,有效保護(hù)根系分生組織細(xì)胞核膜的完整性。葉片噴施甜菜堿對(duì)干旱脅迫引起大麥氧化損傷有明顯的緩解效應(yīng),顯著提高葉片/根系SOD、 CAT、 APX (分別比單獨(dú)PEG-高15.5%/19.8%；13.50%/7.9%;10.0%/31.9%：10.45%/11.3%)抗氧化酶活性。此外,甜菜堿增強(qiáng)干旱脅迫下大麥的光合速率,有效緩解干旱脅迫引起的光合作用抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：干旱脅迫 大麥(Hordeum vulgare L.) 蛋白質(zhì)組學(xué) 西藏野生大麥 質(zhì)譜分析技術(shù) 基因克隆 甜菜堿 活性氧代謝 特異蛋白 超微結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S512.3
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 目錄12-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-30
• 1.1 植物響應(yīng)干旱脅迫的生理機(jī)制14-17
• 1.1.1 干旱脅迫對(duì)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響14
• 1.1.2 干旱脅迫對(duì)植物光合特性的影響14-15
• 1.1.3 干旱脅迫對(duì)植物活性氧代謝的影響15-16
• 1.1.4 干旱脅迫對(duì)植物滲透調(diào)節(jié)的影響16-17
• 1.2 植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展17-26
• 1.2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)與方法18-22
• 1.2.2 植物響應(yīng)非生物脅迫比較蛋白組學(xué)研究進(jìn)展22-26
• 1.3 作物耐旱種質(zhì)鑒定與評(píng)價(jià)研究進(jìn)展26-27
• 1.3.1 耐早鑒定方法26-27
• 1.3.2 耐旱鑒定的評(píng)價(jià)指標(biāo)27
• 1.4 外源甜菜堿緩解干旱脅迫研究進(jìn)展27-28
• 1.5 本研究立題依據(jù)28-30
• 第二章 干旱脅迫對(duì)西藏野生大麥蛋白表達(dá)譜的影響及基因型差異30-55
• 2.1 材料與方法30-34
• 2.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)30-31
• 2.1.2 蛋白質(zhì)樣品制備31
• 2.1.3 蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳31-33
• 2.1.4 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)基因33-34
• 2.2 結(jié)果與分析34-50
• 2.2.1 干旱脅迫和對(duì)照條件下不同大麥基因型葉片蛋白質(zhì)表達(dá)分析34-42
• 2.2.2 干旱脅迫下差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的基因型間比對(duì)及質(zhì)譜鑒定42-45
• 2.2.3 干旱脅迫響應(yīng)蛋白的功能分類45-48
• 2.2.4 干旱脅迫下部分差異表達(dá)蛋白的qRT-PCR驗(yàn)證48-50
• 2.3 討論50-55
• 第三章 西藏野生大麥耐旱相關(guān)基因rbcL與Trx-M的克隆及序列分析55-66
• 3.1 材料與方法55-58
• 3.1.1 試驗(yàn)材料55
• 3.1.2 分子生物學(xué)載體與試劑55
• 3.1.3 總RNA提取55-56
• 3.1.4 cDNA第一鏈合成56
• 3.1.5 基因CDS獲得56-58
• 3.1.6 編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析58
• 3.2 結(jié)果與分析58-64
• 3.2.1 XZ5、XZ54及農(nóng)大3號(hào)rbcL和Trx-M基因CDS的克隆58-60
• 3.2.2 rbcL和Trx-M核苷酸與氨基酸組成差異分析60-62
• 3.2.3 rbcL和Trx-M基因序列同源性分析62-64
• 3.3 討論64-66
• 第四章 外源甜菜堿對(duì)大麥干旱脅迫的緩解效應(yīng)66-77
• 4.1 材料與方法66-68
• 4.1.1 幼苗培養(yǎng)與試驗(yàn)處理66-67
• 4.1.2 分析測(cè)定方法67-68
• 4.1.3 數(shù)據(jù)處理68
• 4.2 結(jié)果與分析68-75
• 4.2.1 外源甜菜堿對(duì)干旱脅迫下大麥幼苗生長(zhǎng)的影響68-69
• 4.2.2 外源甜菜堿對(duì)干旱脅迫下大麥幼苗Na、K含量的影響69-70
• 4.2.3 外源甜菜堿對(duì)干旱脅迫下大麥幼苗抗氧化酶活性的影響70-71
• 4.2.4 外源甜菜堿對(duì)干旱脅迫下大麥光合參數(shù)影響71-72
• 4.2.5 外源甜菜堿對(duì)干旱脅迫下大麥根尖細(xì)胞活力的影響72-73
• 4.2.6 外源甜菜堿對(duì)干旱脅迫下大麥細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響73-75
• 4.3 討論75-77
• 第五章 全文總結(jié)與展望77-79
• 5.1 全文總結(jié)77-78
• 5.2 研究展望78-79
• 參考文獻(xiàn)79-92
• 縮略詞表92-93
• 附錄一：表目錄93-94
• 附錄二：圖目錄94-96
• 博士期間發(fā)表或已投稿的文章96

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 李紅兵;康振生;;適于小麥葉片蛋白質(zhì)組分析的樣品提取方法研究[J];西北植物學(xué)報(bào);2011年03期

2 劉琴;孫輝;何道文;;干旱和高溫對(duì)植物脅迫效應(yīng)的研究進(jìn)展[J];西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年04期

3 王寶山;趙思齊;;干旱對(duì)小麥幼苗膜脂過氧化及保護(hù)酶的影響[J];山東師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1987年01期

4 韋存虛;王建軍;王建波;周衛(wèi)東;孫國(guó)榮;梁建生;;Na_2CO_3脅迫對(duì)星星草葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J];生態(tài)學(xué)報(bào);2006年01期

5 韓瑞宏;盧欣石;高桂娟;楊秀娟;;紫花苜蓿(Medicago sativa)對(duì)干旱脅迫的光合生理響應(yīng)[J];生態(tài)學(xué)報(bào);2007年12期

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本文編號(hào)：930946