本文關(guān)鍵詞：西藏野生大麥耐旱特異蛋白與相關(guān)基因鑒定及外源甜菜堿緩解大麥干旱脅迫生理機理的研究

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【摘要】：干旱是全球范圍內(nèi)限制作物產(chǎn)量最主要的氣象災(zāi)害。培育抗旱作物品種是提高干旱脅迫下作物產(chǎn)量經(jīng)濟有效的途徑；發(fā)掘特異抗/耐旱種質(zhì),明確其耐性機制是培育耐旱新品種和制定耐旱調(diào)控措施的基礎(chǔ)。青藏高原一年生野生大麥(以下簡稱西藏野生大麥)蘊藏著多種抗逆特異基因,為大麥遺傳改良提供了有效的基因庫。本研究以本實驗室前期篩選獲得的耐旱性不同的西藏野生大麥基因型(Hordeum vulgare subsp. spontaneum)為材料,比較分析干旱脅迫下蛋白質(zhì)表達譜的基因型差異,鑒定野生大麥耐旱相關(guān)的目標(biāo)蛋白,克隆耐旱相關(guān)基因,從分子水平上探討野生大麥耐旱機制。同時,探討了外源甜菜堿對干旱脅迫下大麥的緩解效應(yīng)及生理機制,為作物耐旱育種與生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下： 1.干旱脅迫對西藏野生大麥蛋白表達譜的影響及基因型差異 以耐旱西藏野生大麥基因型XZ5及干旱敏感基因型XZ54為材料,以栽培品種浙農(nóng)大3號為對照,盆栽干旱脅迫試驗,設(shè)兩個處理：對照,在整個過程中正常澆水,保持土壤含水量30-40%；干旱脅迫,2葉期開始停止?jié)菜?0d至土壤含水量下降到4%,復(fù)水并保持正常水分供應(yīng)5d。干旱脅迫后分別在土壤含水量達10%(SMC10)、4%(SMC4)及復(fù)水后2d(R1)和5d(R2)時取植株葉片,利用雙向電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù),分析比較干旱脅迫前后的蛋白質(zhì)表達譜及其基因型差異,分離鑒定耐旱相關(guān)特異蛋白。結(jié)果表明,雙向電泳技術(shù)每張膠成功分離到1700多個蛋白點,鑒定到基因型差異表達的與XZ5耐旱相關(guān)的蛋白點38個,質(zhì)譜鑒定和生物信息分析結(jié)果顯示,上述XZ5耐旱相關(guān)的蛋白分別屬于光合作用、逆境脅迫反應(yīng)、新陳代謝、能量和氨基酸生物合成,包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基(rbcL, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)和m型硫氧化還原蛋白(Trx-M, Thioredoxin M, chloroplast precursor)。其中,6個蛋白點在XZ5特異上調(diào)表達,包括黑色素瘤相關(guān)抗原p7(melanoma-associated antigen p97)、I型葉綠素a/b結(jié)合蛋白b (type Ⅰ chlorophyll a/b-binding protein b)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶1(glutathione S-transferase1)和二磷酸核酮糖羧化酶大亞基(ribulosebisphosphate carboxylase large chain),其中的I型葉綠素a/b結(jié)合蛋白b僅在XZ5中特異表達(XZ54和浙農(nóng)大3號中均沒有檢測到這個蛋白點)。說明這些蛋白可能與耐旱基因型XZ5耐旱性緊密相關(guān)。 2.西藏野生大麥不同基因型rbcL與Trx-M干旱響應(yīng)基因CDS克隆及序列分析 利用簡并PCR技術(shù)從XZ5、XZ54及浙農(nóng)大3號大麥基因型葉片中分離rbcL和Trx-M基因編碼區(qū)序列,分別為1401bp(部分CDS區(qū)序列)和528bp(全部CDS區(qū)序列)兩個基因分別編碼467和176個氨基酸,均無內(nèi)含子。且該基因核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列與小麥、水稻、玉米、甘蔗及大豆等植物具有較高的同源性。經(jīng)序列比對分析,發(fā)現(xiàn)rbcL基因核苷酸序列在XZ5和XZ54中存在差異,在編碼區(qū)序列存在5個SNPs (single nucleotide polymorphism),其中的2個SNPs為錯義突變。另外,Trx-M基因核苷酸序列在XZ5、 XZ54和浙農(nóng)大3號中存在差異,在保守結(jié)構(gòu)域中有3個SNPs,均為錯義突變,說明這些錯義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異,從而可能影響其功能。采用ExPASy數(shù)據(jù)庫工具分析rbcL和Trx-M基因的理化特性,結(jié)果表明這兩個基因所編碼的氨基酸序列的蛋白分子量分別為5.17和1.92KDa,等電點分別為6.44和8.57。經(jīng)SignalP軟件預(yù)測出這兩個基因均不含信號肽,為非分泌型蛋白。利用NCBI-BLASTP檢索大麥rbcL和Trχ-M基因編碼氨基酸序列同源的物種,并通過ClustalX軟件對其進行多重序列比對,發(fā)現(xiàn)兩個基因其進化過程中有較強的保守性。進一步通過ANTHEPROT軟件完整預(yù)測出rbcL和Trx-M的二級結(jié)構(gòu)：rbcL二級結(jié)構(gòu)為α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲分別占37%、19%、24%、20%；Trx-M二級結(jié)構(gòu)為α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲分別占31%、29%、26%、14%。通過在線Phyre2預(yù)測出rbcL和Trx-M的三級結(jié)構(gòu)。此外,SMART (http://smart. embl-heidelberg.de/)在線預(yù)測軟件對rbcL和Trx-M的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域進行分析,發(fā)現(xiàn)rbcL蛋白含兩個保守結(jié)構(gòu)域；21～146bp大麥不同基因型XZ5、 XZ54和浙農(nóng)大3號)區(qū)間為RuBisco large N結(jié)構(gòu)域；154-462bp (XZ5),154～433(XZ54)和154-462(浙農(nóng)大3號)區(qū)間為RuBisco large結(jié)構(gòu)域。推測其功能是在RuBisco羧化酶的活性及對鎂離子綁定方面發(fā)揮作用。其中69-172(大麥不同基因型XZ5、 XZ54和浙農(nóng)大3號)區(qū)間為Trx-M結(jié)構(gòu)域。 3.外源甜菜堿對大麥干旱脅迫的緩解效應(yīng) 以大麥品種浙大9號為材料,水培20%PEG6000模擬干旱脅迫試驗,設(shè)4個處理：對照(基本培養(yǎng)液BNS)、 Betaine (BNS+(?)十片噴施5OOμM Betaine)、 Drought (BNS+20%PEG6000)、 Drought+Betaine (BNS+葉片噴施5OOμM Betaine+20%PEG6000),研究外源甜菜堿對干旱所致大麥損傷的緩解作用。結(jié)果表明,20%PEG6000模擬干旱肋迫環(huán)境下,葉面噴施甜菜堿(Drought+Betaine)能顯著緩解干旱對大麥幼苗的損害,株高、根長及生物量都比單獨PEG干旱脅迫有顯著提高。外源甜菜堿顯著影響細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及活性氧代謝,顯著緩解干旱脅迫引起的葉綠體和根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害,有效保護根系分生組織細(xì)胞核膜的完整性。葉片噴施甜菜堿對干旱脅迫引起大麥氧化損傷有明顯的緩解效應(yīng),顯著提高葉片/根系SOD、 CAT、 APX (分別比單獨PEG-高15.5%/19.8%；13.50%/7.9%;10.0%/31.9%：10.45%/11.3%)抗氧化酶活性。此外,甜菜堿增強干旱脅迫下大麥的光合速率,有效緩解干旱脅迫引起的光合作用抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：干旱脅迫 大麥(Hordeum vulgare L.) 蛋白質(zhì)組學(xué) 西藏野生大麥 質(zhì)譜分析技術(shù) 基因克隆 甜菜堿 活性氧代謝 特異蛋白 超微結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S512.3
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 目錄12-14
• 第一章 文獻綜述14-30
• 1.1 植物響應(yīng)干旱脅迫的生理機制14-17
• 1.1.1 干旱脅迫對植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響14
• 1.1.2 干旱脅迫對植物光合特性的影響14-15
• 1.1.3 干旱脅迫對植物活性氧代謝的影響15-16
• 1.1.4 干旱脅迫對植物滲透調(diào)節(jié)的影響16-17
• 1.2 植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展17-26
• 1.2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)與方法18-22
• 1.2.2 植物響應(yīng)非生物脅迫比較蛋白組學(xué)研究進展22-26
• 1.3 作物耐旱種質(zhì)鑒定與評價研究進展26-27
• 1.3.1 耐早鑒定方法26-27
• 1.3.2 耐旱鑒定的評價指標(biāo)27
• 1.4 外源甜菜堿緩解干旱脅迫研究進展27-28
• 1.5 本研究立題依據(jù)28-30
• 第二章 干旱脅迫對西藏野生大麥蛋白表達譜的影響及基因型差異30-55
• 2.1 材料與方法30-34
• 2.1.1 試驗設(shè)計30-31
• 2.1.2 蛋白質(zhì)樣品制備31
• 2.1.3 蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳31-33
• 2.1.4 實時定量PCR驗證部分差異表達基因33-34
• 2.2 結(jié)果與分析34-50
• 2.2.1 干旱脅迫和對照條件下不同大麥基因型葉片蛋白質(zhì)表達分析34-42
• 2.2.2 干旱脅迫下差異表達蛋白點的基因型間比對及質(zhì)譜鑒定42-45
• 2.2.3 干旱脅迫響應(yīng)蛋白的功能分類45-48
• 2.2.4 干旱脅迫下部分差異表達蛋白的qRT-PCR驗證48-50
• 2.3 討論50-55
• 第三章 西藏野生大麥耐旱相關(guān)基因rbcL與Trx-M的克隆及序列分析55-66
• 3.1 材料與方法55-58
• 3.1.1 試驗材料55
• 3.1.2 分子生物學(xué)載體與試劑55
• 3.1.3 總RNA提取55-56
• 3.1.4 cDNA第一鏈合成56
• 3.1.5 基因CDS獲得56-58
• 3.1.6 編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析58
• 3.2 結(jié)果與分析58-64
• 3.2.1 XZ5、XZ54及農(nóng)大3號rbcL和Trx-M基因CDS的克隆58-60
• 3.2.2 rbcL和Trx-M核苷酸與氨基酸組成差異分析60-62
• 3.2.3 rbcL和Trx-M基因序列同源性分析62-64
• 3.3 討論64-66
• 第四章 外源甜菜堿對大麥干旱脅迫的緩解效應(yīng)66-77
• 4.1 材料與方法66-68
• 4.1.1 幼苗培養(yǎng)與試驗處理66-67
• 4.1.2 分析測定方法67-68
• 4.1.3 數(shù)據(jù)處理68
• 4.2 結(jié)果與分析68-75
• 4.2.1 外源甜菜堿對干旱脅迫下大麥幼苗生長的影響68-69
• 4.2.2 外源甜菜堿對干旱脅迫下大麥幼苗Na、K含量的影響69-70
• 4.2.3 外源甜菜堿對干旱脅迫下大麥幼苗抗氧化酶活性的影響70-71
• 4.2.4 外源甜菜堿對干旱脅迫下大麥光合參數(shù)影響71-72
• 4.2.5 外源甜菜堿對干旱脅迫下大麥根尖細(xì)胞活力的影響72-73
• 4.2.6 外源甜菜堿對干旱脅迫下大麥細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響73-75
• 4.3 討論75-77
• 第五章 全文總結(jié)與展望77-79
• 5.1 全文總結(jié)77-78
• 5.2 研究展望78-79
• 參考文獻79-92
• 縮略詞表92-93
• 附錄一：表目錄93-94
• 附錄二：圖目錄94-96
• 博士期間發(fā)表或已投稿的文章96

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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3 王寶山;趙思齊;;干旱對小麥幼苗膜脂過氧化及保護酶的影響[J];山東師大學(xué)報(自然科學(xué)版);1987年01期

4 韋存虛;王建軍;王建波;周衛(wèi)東;孫國榮;梁建生;;Na_2CO_3脅迫對星星草葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J];生態(tài)學(xué)報;2006年01期

5 韓瑞宏;盧欣石;高桂娟;楊秀娟;;紫花苜蓿(Medicago sativa)對干旱脅迫的光合生理響應(yīng)[J];生態(tài)學(xué)報;2007年12期

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本文編號：930946