本文關(guān)鍵詞：鴨RIG-I在免疫調(diào)節(jié)中的作用及分子調(diào)控機(jī)制

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【摘要】：近年來,禽流感特別是高致病性禽流感給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性的打擊,并引發(fā)一系列的公共衛(wèi)生安全問題。雞、鴨同為家禽,對流感病毒有著不同的敏感性,這與宿主本身抗性基因和免疫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控存在著密切的關(guān)系。維甲酸誘導(dǎo)基因I (Retinoic acid inducible gene Ⅰ, RIG-I)能識別流感病毒并觸發(fā)先天性免疫,該基因在雞基因組上缺失,鴨基因組中保留,這種缺失使得雞與其他禽類相比對禽流感病毒更易感、臨床癥狀更明顯。但到目前為止,鴨RIG-I是如何發(fā)揮抗病毒作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)嘗試從不同角度闡釋鴨RIG-I在免疫調(diào)節(jié)中的作用及分子調(diào)控機(jī)制,旨在揭示duRIG-I在抗病毒先天性免疫信號傳遞途徑及其代償機(jī)制,并以期進(jìn)一步完善雞體內(nèi)抗病毒先天性免疫途徑及禽類免疫系統(tǒng)相關(guān)的基礎(chǔ)研究。主要研究內(nèi)容如下：1.為探討duRIG-I基因的功能,首先克隆獲得了duRIG-I cDNA序列,提交GenBank(登錄號為JQ946323.2和KC869660.1),發(fā)現(xiàn)了3'UTR存在可變剪接體；間接免疫熒光方法檢測結(jié)果顯示duRIG-I蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì),其次位于細(xì)胞核,進(jìn)一步證實(shí)了該蛋白為胞質(zhì)受體；半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示duRIG-I在心、肝、腎、腺胃、大腸、小腸、肌肉、胸腺和下丘腦等組織的本底表達(dá)均處于較低水平,僅在脾臟和肺臟組織中有少量表達(dá)；進(jìn)一步采用poly[I:C]模擬病毒感染,實(shí)時定量PCR檢測感染96h內(nèi)的脾臟和肝臟中的duRIG-I基因的mRNA動態(tài)表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)感染8h后脾臟和肝臟中duRIG-I基因表達(dá)量均顯著上升(P0.05)。2.基于上述duRIG-I基因呈誘導(dǎo)性表達(dá)的特點(diǎn),我們開展了duRIG-I表達(dá)調(diào)控研究。首先克隆了duRIG-I啟動子區(qū),在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)存在一個明顯的CpG島,但BSP進(jìn)一步檢測結(jié)果顯示,脾臟等中RIG-I啟動子區(qū)的CpG島處于非甲基化狀態(tài)。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測duRIG-I基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果顯示,在+14～-301 bp存在正調(diào)控,該區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果表明,IRF1等反式作用因子可能起著重要作用。3.為了證實(shí)duRIG-I的激活機(jī)制,對duRIG-I進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測,發(fā)現(xiàn)duRIG-I基因具有RLRs家族的典型特征(包括CARD結(jié)構(gòu)域、RNA解旋酶等功能結(jié)構(gòu)域),據(jù)此構(gòu)建了不同結(jié)構(gòu)域缺失突變體的表達(dá)載體,經(jīng)RT-PCR,間接免疫熒光和Western blot方法鑒定重組質(zhì)粒的表達(dá),利用RT-qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CARD結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表達(dá)顯著上調(diào)；進(jìn)一步采用NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)和ELISA檢測poly[I:C]介導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)poly[I:C]誘導(dǎo),duRIG-Ⅰ被顯著激活,同時CARDs結(jié)構(gòu)域能夠通過激活NF-κB促使IFN-β的產(chǎn)生。4.為進(jìn)一步探索duRIG-I基因在抗病毒先天性免疫中的作用,慢病毒介導(dǎo)的duRIG-I基因在DF-1細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá),獲得了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株DF-1/LV5-RIG-I和DF-1/LV5,并用RT-PCR及Western Blot驗(yàn)證duRIG-I基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況,為下一步研究提供了細(xì)胞模型。5.為探索duRIG-I在抗病毒先天性免疫信號傳遞途徑及其代償機(jī)制,我們利用5'ppp-dsRNA模擬病毒感染,進(jìn)行RNA-seq,共篩選出278個差異基因(duRIG-I基因介導(dǎo)的應(yīng)答基因),其中120個差異基因被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中,富集分析最可靠的通路為RIG-I樣受體信號通路；GO二級功能的富集分析主要富集在Ⅰ型干擾素信號通路、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性正向調(diào)控、β干擾素的細(xì)胞應(yīng)答、RIG-I信號通路的正向調(diào)控等條目；通過Cytoscape軟件,基于通路上共有的差異基因,構(gòu)建了RIG-I信號通路與其他信號通路交聯(lián)的關(guān)系網(wǎng)路圖,推測Jak-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體關(guān)聯(lián)、Wnt信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、MAPK信號通路等在抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中可能與RIG-I介導(dǎo)的通路存在分子交聯(lián)；經(jīng)進(jìn)一步篩選得到RIG-I介導(dǎo)信號通路關(guān)鍵應(yīng)答基因,如ISG12-2、OSA*A、Mx1、IFIT5、TRIM25、USP18、STAT1、STAT2、IRF1、 IRF3、IRF8等,Real-time PCR驗(yàn)證差異基因表達(dá)趨勢與測序結(jié)果相一致,并結(jié)合已有文獻(xiàn)報道,提出了雞中的RIG-I基因介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的假設(shè)圖。
【關(guān)鍵詞】：鴨 RIG-I 表達(dá)調(diào)控 信號通路
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 符號說明11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1 先天性免疫概述12-14
• 1.1 先天性免疫12-13
• 1.2 模式識別受體13-14
• 2 RIG-I研究進(jìn)展14-22
• 2.1 RIG-I的分子結(jié)構(gòu)14-15
• 2.2 RIG-I的激活機(jī)制15
• 2.3 RIG-I識別的配體15-19
• 2.4 RIG-I誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素中的作用19
• 2.5 RIG-I介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控19-20
• 2.6 病毒干擾RIG-I介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)20-22
• 3 RIG-I在家禽上的研究進(jìn)展22
• 4 研究的目的和意義22-24
• 第二章 鴨RIG-I基因克隆、表達(dá)及結(jié)構(gòu)域功能的初步分析24-52
• 1 材料和方法24-31
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物24
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑24-25
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法25-31
• 1.2.1 總RNA提取及cDNA合成25
• 1.2.2 基因全長獲取25-27
• 1.2.3 生物信息學(xué)分析27-28
• 1.2.4 啟動子系列缺失表達(dá)載體的構(gòu)建28
• 1.2.5 結(jié)構(gòu)域缺失突變體的構(gòu)建28-29
• 1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)與瞬時轉(zhuǎn)染29
• 1.2.7 間接免疫熒光29
• 1.2.8 熒光定量PCR分析29-30
• 1.2.9 Western blot30
• 1.2.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)30
• 1.2.11 BSP實(shí)驗(yàn)(亞硫酸鹽測序)30-31
• 1.2.12 數(shù)據(jù)處理與分析31
• 2 結(jié)果與分析31-49
• 2.1 鴨RIG-I基因克隆與序列分析31-36
• 2.1.1 鴨RIG-I基因克隆31-32
• 2.1.2 鴨RIG-I基因序列分析與分子進(jìn)化分析32-36
• 2.2 鴨RIG-I基因表達(dá)規(guī)律分析36-38
• 2.2.1 鴨RIG-I基因亞細(xì)胞定位36-37
• 2.2.2 鴨RIG-I基因不同組織表達(dá)規(guī)律分析37
• 2.2.3 poly[I：C]模擬病毒感染對鴨RIG-I基因表達(dá)的影響37-38
• 2.3 鴨RIG-I基因啟動子克隆及甲基化分析38-42
• 2.3.1 鴨RIG-I基因啟動子區(qū)克隆及序列分析38-39
• 2.3.2 鴨RIG-I基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的檢測39-40
• 2.3.3 鴨RIG-I基因甲基化分析40-42
• 2.4 鴨RIG-I基因結(jié)構(gòu)域功能的初步分析42-49
• 2.4.1 鴨RIG-I全長及不同結(jié)構(gòu)域的缺失突變體的構(gòu)建及鑒定42-47
• 2.4.2 鴨RIG-I不同結(jié)構(gòu)域?qū)LR信號通路誘導(dǎo)激活作用47-48
• 2.4.3 poly[I：C]誘導(dǎo)下,不同結(jié)構(gòu)域的表達(dá)對IFN-p表達(dá)的影響48-49
• 3 討論49-52
• 第三章 RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號通路調(diào)控機(jī)制研究52-80
• 1 材料與方法52-58
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料52-53
• 1.1.1 慢病毒法建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株相關(guān)材料52
• 1.1.2 轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料52-53
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法53-58
• 1.2.1 慢病毒法建立過表達(dá)duRIG-I-His的DF-1細(xì)胞株53-54
• 1.2.2 5'ppp-dsRNA模擬病毒感染實(shí)驗(yàn)54
• 1.2.3 RNA-Seq樣品制備及測序54-55
• 1.2.4 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析55-56
• 1.2.5 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)差異基因熒光定量PCR驗(yàn)證56-58
• 2 結(jié)果與分析58-77
• 2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)duRIG-I基因在DF-1細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)58-63
• 2.1.1 DF-1細(xì)胞慢病毒感染效率評價58-59
• 2.1.2 Puromycin致死濃度篩選59-60
• 2.1.3 DF-1靶細(xì)胞感染與穩(wěn)轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)60-63
• 2.1.4 Real-time PCR及western blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株63
• 2.2 RNA提取及質(zhì)量檢測63-64
• 2.3 RNA-Seq產(chǎn)量統(tǒng)計與評估64-65
• 2.3.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與評估64-65
• 2.3.2 RNA-Seq整體質(zhì)量評估65
• 2.4 基因表達(dá)水平分析65-68
• 2.4.1 基因表達(dá)定量65
• 2.4.2 RIG-I基因的定量分析65-67
• 2.4.3 樣品重復(fù)性檢驗(yàn)67-68
• 2.5 RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號通路相關(guān)基因表達(dá)分析68-74
• 2.5.1 差異表達(dá)基因篩選68-69
• 2.5.2 差異表達(dá)基因相關(guān)信號通路的富集69-71
• 2.5.3 差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系71-74
• 2.6 差異表達(dá)基因的實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證74-77
• 2.7 RIG-I基因介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的假設(shè)圖構(gòu)建77
• 3 討論77-80
• 3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)鴨RIG-I蛋白DF-1細(xì)胞系的建立77-78
• 3.2 抗病毒信號通路的crosstalk78-79
• 3.3 鴨RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號通路中泛素分子的響應(yīng)79
• 3.4 鴨RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號通路應(yīng)答基因79-80
• 全文結(jié)論80-81
• 主要創(chuàng)新點(diǎn)81
• 進(jìn)一步研究設(shè)想81-82
• 參考文獻(xiàn)82-93
• 附錄93-100
• 致謝100-101
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄101-103

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本文編號：926823