本文關鍵詞：鴨RIG-I在免疫調節(jié)中的作用及分子調控機制

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【摘要】：近年來,禽流感特別是高致病性禽流感給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性的打擊,并引發(fā)一系列的公共衛(wèi)生安全問題。雞、鴨同為家禽,對流感病毒有著不同的敏感性,這與宿主本身抗性基因和免疫相關基因的表達調控存在著密切的關系。維甲酸誘導基因I (Retinoic acid inducible gene Ⅰ, RIG-I)能識別流感病毒并觸發(fā)先天性免疫,該基因在雞基因組上缺失,鴨基因組中保留,這種缺失使得雞與其他禽類相比對禽流感病毒更易感、臨床癥狀更明顯。但到目前為止,鴨RIG-I是如何發(fā)揮抗病毒作用尚不清楚。本實驗嘗試從不同角度闡釋鴨RIG-I在免疫調節(jié)中的作用及分子調控機制,旨在揭示duRIG-I在抗病毒先天性免疫信號傳遞途徑及其代償機制,并以期進一步完善雞體內(nèi)抗病毒先天性免疫途徑及禽類免疫系統(tǒng)相關的基礎研究。主要研究內(nèi)容如下：1.為探討duRIG-I基因的功能,首先克隆獲得了duRIG-I cDNA序列,提交GenBank(登錄號為JQ946323.2和KC869660.1),發(fā)現(xiàn)了3'UTR存在可變剪接體；間接免疫熒光方法檢測結果顯示duRIG-I蛋白主要位于細胞質,其次位于細胞核,進一步證實了該蛋白為胞質受體；半定量RT-PCR檢測結果顯示duRIG-I在心、肝、腎、腺胃、大腸、小腸、肌肉、胸腺和下丘腦等組織的本底表達均處于較低水平,僅在脾臟和肺臟組織中有少量表達；進一步采用poly[I:C]模擬病毒感染,實時定量PCR檢測感染96h內(nèi)的脾臟和肝臟中的duRIG-I基因的mRNA動態(tài)表達變化,發(fā)現(xiàn)感染8h后脾臟和肝臟中duRIG-I基因表達量均顯著上升(P0.05)。2.基于上述duRIG-I基因呈誘導性表達的特點,我們開展了duRIG-I表達調控研究。首先克隆了duRIG-I啟動子區(qū),在線預測發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)存在一個明顯的CpG島,但BSP進一步檢測結果顯示,脾臟等中RIG-I啟動子區(qū)的CpG島處于非甲基化狀態(tài)。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測duRIG-I基因啟動子轉錄活性結果顯示,在+14～-301 bp存在正調控,該區(qū)的轉錄因子結合位點預測結果表明,IRF1等反式作用因子可能起著重要作用。3.為了證實duRIG-I的激活機制,對duRIG-I進行保守結構域預測,發(fā)現(xiàn)duRIG-I基因具有RLRs家族的典型特征(包括CARD結構域、RNA解旋酶等功能結構域),據(jù)此構建了不同結構域缺失突變體的表達載體,經(jīng)RT-PCR,間接免疫熒光和Western blot方法鑒定重組質粒的表達,利用RT-qPCR檢測結果發(fā)現(xiàn)CARD結構域能介導RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表達顯著上調；進一步采用NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)和ELISA檢測poly[I:C]介導的IFN-β的表達量,結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)poly[I:C]誘導,duRIG-Ⅰ被顯著激活,同時CARDs結構域能夠通過激活NF-κB促使IFN-β的產(chǎn)生。4.為進一步探索duRIG-I基因在抗病毒先天性免疫中的作用,慢病毒介導的duRIG-I基因在DF-1細胞中持續(xù)穩(wěn)定高表達,獲得了穩(wěn)轉細胞株DF-1/LV5-RIG-I和DF-1/LV5,并用RT-PCR及Western Blot驗證duRIG-I基因mRNA水平和蛋白水平的表達情況,為下一步研究提供了細胞模型。5.為探索duRIG-I在抗病毒先天性免疫信號傳遞途徑及其代償機制,我們利用5'ppp-dsRNA模擬病毒感染,進行RNA-seq,共篩選出278個差異基因(duRIG-I基因介導的應答基因),其中120個差異基因被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中,富集分析最可靠的通路為RIG-I樣受體信號通路；GO二級功能的富集分析主要富集在Ⅰ型干擾素信號通路、T細胞介導的細胞毒性正向調控、β干擾素的細胞應答、RIG-I信號通路的正向調控等條目；通過Cytoscape軟件,基于通路上共有的差異基因,構建了RIG-I信號通路與其他信號通路交聯(lián)的關系網(wǎng)路圖,推測Jak-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體關聯(lián)、Wnt信號通路、泛素介導的蛋白水解作用、MAPK信號通路等在抗病毒信號轉導過程中可能與RIG-I介導的通路存在分子交聯(lián)；經(jīng)進一步篩選得到RIG-I介導信號通路關鍵應答基因,如ISG12-2、OSA*A、Mx1、IFIT5、TRIM25、USP18、STAT1、STAT2、IRF1、 IRF3、IRF8等,Real-time PCR驗證差異基因表達趨勢與測序結果相一致,并結合已有文獻報道,提出了雞中的RIG-I基因介導的信號轉導的假設圖。
【關鍵詞】：鴨 RIG-I 表達調控 信號通路
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 符號說明11-12
• 第一章 文獻綜述12-24
• 1 先天性免疫概述12-14
• 1.1 先天性免疫12-13
• 1.2 模式識別受體13-14
• 2 RIG-I研究進展14-22
• 2.1 RIG-I的分子結構14-15
• 2.2 RIG-I的激活機制15
• 2.3 RIG-I識別的配體15-19
• 2.4 RIG-I誘導Ⅰ型干擾素中的作用19
• 2.5 RIG-I介導的信號轉導調控19-20
• 2.6 病毒干擾RIG-I介導的信號轉導20-22
• 3 RIG-I在家禽上的研究進展22
• 4 研究的目的和意義22-24
• 第二章 鴨RIG-I基因克隆、表達及結構域功能的初步分析24-52
• 1 材料和方法24-31
• 1.1 實驗材料24-25
• 1.1.1 實驗動物24
• 1.1.2 實驗試劑24-25
• 1.2 實驗方法25-31
• 1.2.1 總RNA提取及cDNA合成25
• 1.2.2 基因全長獲取25-27
• 1.2.3 生物信息學分析27-28
• 1.2.4 啟動子系列缺失表達載體的構建28
• 1.2.5 結構域缺失突變體的構建28-29
• 1.2.6 細胞培養(yǎng)與瞬時轉染29
• 1.2.7 間接免疫熒光29
• 1.2.8 熒光定量PCR分析29-30
• 1.2.9 Western blot30
• 1.2.10 雙熒光素酶報告基因實驗30
• 1.2.11 BSP實驗(亞硫酸鹽測序)30-31
• 1.2.12 數(shù)據(jù)處理與分析31
• 2 結果與分析31-49
• 2.1 鴨RIG-I基因克隆與序列分析31-36
• 2.1.1 鴨RIG-I基因克隆31-32
• 2.1.2 鴨RIG-I基因序列分析與分子進化分析32-36
• 2.2 鴨RIG-I基因表達規(guī)律分析36-38
• 2.2.1 鴨RIG-I基因亞細胞定位36-37
• 2.2.2 鴨RIG-I基因不同組織表達規(guī)律分析37
• 2.2.3 poly[I：C]模擬病毒感染對鴨RIG-I基因表達的影響37-38
• 2.3 鴨RIG-I基因啟動子克隆及甲基化分析38-42
• 2.3.1 鴨RIG-I基因啟動子區(qū)克隆及序列分析38-39
• 2.3.2 鴨RIG-I基因啟動子轉錄活性的檢測39-40
• 2.3.3 鴨RIG-I基因甲基化分析40-42
• 2.4 鴨RIG-I基因結構域功能的初步分析42-49
• 2.4.1 鴨RIG-I全長及不同結構域的缺失突變體的構建及鑒定42-47
• 2.4.2 鴨RIG-I不同結構域對RLR信號通路誘導激活作用47-48
• 2.4.3 poly[I：C]誘導下,不同結構域的表達對IFN-p表達的影響48-49
• 3 討論49-52
• 第三章 RIG-I介導的抗病毒信號通路調控機制研究52-80
• 1 材料與方法52-58
• 1.1 實驗材料52-53
• 1.1.1 慢病毒法建立穩(wěn)轉細胞株相關材料52
• 1.1.2 轉錄組實驗相關材料52-53
• 1.2 實驗方法53-58
• 1.2.1 慢病毒法建立過表達duRIG-I-His的DF-1細胞株53-54
• 1.2.2 5'ppp-dsRNA模擬病毒感染實驗54
• 1.2.3 RNA-Seq樣品制備及測序54-55
• 1.2.4 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)處理及生物信息學分析55-56
• 1.2.5 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)差異基因熒光定量PCR驗證56-58
• 2 結果與分析58-77
• 2.1 慢病毒轉染技術實現(xiàn)duRIG-I基因在DF-1細胞中持續(xù)穩(wěn)定高表達58-63
• 2.1.1 DF-1細胞慢病毒感染效率評價58-59
• 2.1.2 Puromycin致死濃度篩選59-60
• 2.1.3 DF-1靶細胞感染與穩(wěn)轉實驗60-63
• 2.1.4 Real-time PCR及western blot檢測穩(wěn)轉細胞株63
• 2.2 RNA提取及質量檢測63-64
• 2.3 RNA-Seq產(chǎn)量統(tǒng)計與評估64-65
• 2.3.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與評估64-65
• 2.3.2 RNA-Seq整體質量評估65
• 2.4 基因表達水平分析65-68
• 2.4.1 基因表達定量65
• 2.4.2 RIG-I基因的定量分析65-67
• 2.4.3 樣品重復性檢驗67-68
• 2.5 RIG-I介導的抗病毒信號通路相關基因表達分析68-74
• 2.5.1 差異表達基因篩選68-69
• 2.5.2 差異表達基因相關信號通路的富集69-71
• 2.5.3 差異表達基因網(wǎng)絡關系71-74
• 2.6 差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證74-77
• 2.7 RIG-I基因介導的信號轉導的假設圖構建77
• 3 討論77-80
• 3.1 穩(wěn)轉鴨RIG-I蛋白DF-1細胞系的建立77-78
• 3.2 抗病毒信號通路的crosstalk78-79
• 3.3 鴨RIG-I介導的抗病毒信號通路中泛素分子的響應79
• 3.4 鴨RIG-I介導的抗病毒信號通路應答基因79-80
• 全文結論80-81
• 主要創(chuàng)新點81
• 進一步研究設想81-82
• 參考文獻82-93
• 附錄93-100
• 致謝100-101
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄101-103

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本文編號：926823