本文關(guān)鍵詞：寄生疫霉菌與寄主植物特異性互作的初步研究

  更多相關(guān)文章： 寄生疫霉菌 擬南芥 寄主特異性 遺傳分析 本氏煙 細(xì)胞壞死 二硫異構(gòu)酶 吸器 毒性因子

【摘要】：卵菌是一類形態(tài)上與真菌相似,但在進(jìn)化關(guān)系上與硅藻和褐藻極為相近的真核微生物。卵菌中包含很多來自植物、動(dòng)物的病原微生物,其中疫霉屬中一些成員是對(duì)植物具有毀滅性的病原菌。由于卵菌獨(dú)特的生理生化特性,絕大部分有效的殺菌劑防治卵菌病害效果極差。近年來,卵菌病原菌在遺傳、進(jìn)化以及與寄主植物互作等方面取得了飛速的進(jìn)展,極大地推動(dòng)了對(duì)病原菌致病機(jī)制和毒性遺傳變異規(guī)律的認(rèn)識(shí)。然而,對(duì)卵菌疫霉屬的認(rèn)識(shí)主要集中于少數(shù)一些物種,尤其是寄主范圍較窄的致病疫霉菌和大豆疫霉菌。相比較而言,寄生疫霉菌是典型的土傳病害病原菌,寄主范圍廣泛,在疫霉屬中具有代表性。對(duì)寄生疫霉菌與寄主植物互作的分子生物學(xué)基礎(chǔ)的研究,有助于全面認(rèn)識(shí)卵菌致病的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制,對(duì)卵菌病害的防治策略有十分重要的意義。在本研究中,我們旨在以寄生疫霉菌作為模式探索卵菌的致病機(jī)制。一方面,我們以實(shí)驗(yàn)室前期建立的寄生疫霉菌侵染模式植物擬南芥的親和互作系統(tǒng)為基礎(chǔ),通過對(duì)表型變異的描述明確寄生疫霉菌與擬南芥存在特異性互作,進(jìn)一步完善該親和互作系統(tǒng)。另一方面,我們嘗試借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高通量篩選寄生疫霉菌侵染煙草葉片的c DNA文庫,得到與寄生疫霉菌侵染相關(guān)的致病因子。文庫篩選中,我們鑒定到一個(gè)來自寄生疫霉菌的二硫異構(gòu)酶基因Pp PDI1,并通過分析該基因的壞死誘導(dǎo)功能,表達(dá)特征、基因沉默以及過表達(dá)轉(zhuǎn)化子,旨在揭示Pp PDI1在病原菌生長(zhǎng)發(fā)育以及侵染過程中的作用。主要研究結(jié)果如下:1.系統(tǒng)研究了寄生疫霉菌和擬南芥互作的表型變異,主要包括病原菌侵染定殖程度和產(chǎn)孢情況以及寄主植物的抗性反應(yīng)。根部和葉部接菌測(cè)試表明,寄生疫霉菌菌株與寄主植物擬南芥生態(tài)型之間存在特異性互作。其中,擬南芥生態(tài)型Zurich(Zu-1)對(duì)寄生疫霉菌Pp016表現(xiàn)免疫,并且對(duì)于測(cè)試的20個(gè)多樣性的寄生疫霉菌菌株具有廣譜抗病性。進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)觀察表明,病原菌最初侵染的植物表皮細(xì)胞發(fā)生快速和劇烈的過敏性細(xì)胞壞死反應(yīng),從而抑制了病原菌的侵染。2.遺傳分析表明擬南芥Zu-1對(duì)寄生疫霉菌的抗性由半顯性單基因位點(diǎn)控制。將抗病生態(tài)型Zu-1與感病生態(tài)型Landsberg(Ler)進(jìn)行遺傳雜交,對(duì)其后代進(jìn)行接菌分析,我們發(fā)現(xiàn)F1植株葉片發(fā)黃,病斑擴(kuò)展受到限制,表現(xiàn)中間型的表型;F2群體出現(xiàn)了分離,且分離比(N:Y:H)接近1:2:1(χ2=0.307,P=0.8578)。遺傳分析數(shù)據(jù)表明擬南芥Zu-1的抗病性可能是由半顯性的單基因位點(diǎn)控制,我們將這個(gè)位點(diǎn)定義為RPPA1Zu-1(for Resistance to Phytophthora parasitica 1),并通過Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing(SLAF-seq)測(cè)序分析,將該位點(diǎn)初步定位于擬南芥IV染色體7.1-11.2Mb區(qū)域。3.功能篩選鑒定參與植物-寄生疫霉菌互作的關(guān)鍵基因。通過構(gòu)建寄生疫霉菌侵染煙草葉片的高質(zhì)量的c DNA文庫,以植物細(xì)胞壞死為表型,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在普通煙草和本氏煙葉片上對(duì)文庫進(jìn)行高通量的篩選,從篩選的16,000個(gè)c DNA克隆中,獲得24個(gè)具有誘導(dǎo)壞死反應(yīng)活性的候選蛋白。在篩選得到的候選蛋白中,我們對(duì)一個(gè)來自寄生疫霉菌的二硫異構(gòu)酶蛋白(Pp PDI1)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析,確認(rèn)了其在本氏煙的葉片上引發(fā)強(qiáng)烈的壞死反應(yīng)。Pp PDI1包含TRX-like結(jié)構(gòu)域,在真核生物中非常保守。缺失突變體分析表明,Pp PDI第一個(gè)TRX-like結(jié)構(gòu)域的催化位點(diǎn)CGHC對(duì)誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死活性至關(guān)重要。4.初步確認(rèn)Pp PDI1作為一個(gè)毒性因子,在寄生疫霉菌侵染寄主植物過程中發(fā)揮作用。Pp PDI1基因在寄生疫霉菌的所有階段都有表達(dá),但相對(duì)于萌發(fā)休止孢階段和侵染早期(36hpi),在侵染后期(60hpi)上調(diào)表達(dá)。為了進(jìn)一步探索Pp PDI1在寄生疫霉菌侵染過程中的作用,我們利用遺傳轉(zhuǎn)化,分別得到基因沉默和過表達(dá)的轉(zhuǎn)化子。對(duì)基因沉默的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Pp PDI1的沉默效率非常低,并且該基因的表達(dá)水平隨后恢復(fù),表明Pp PDI1的表達(dá)受到一定的選擇性,可能是病原菌生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。對(duì)過表達(dá)Pp PDI1與EGFP融合的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在侵染過程中,Pp PDI1在吸器處高度累積。與對(duì)照1121相比較,過表達(dá)Pp PDI1-EGFP轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的吸器數(shù)量明顯增加。此外,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,過表達(dá)的轉(zhuǎn)化子在侵染過程中生物定殖量增多。綜上,我們推測(cè)Pp PDI1有可能作為一個(gè)毒性因子在寄生疫霉菌侵染寄主植物過程中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：寄生疫霉菌 擬南芥 寄主特異性 遺傳分析 本氏煙 細(xì)胞壞死 二硫異構(gòu)酶 吸器 毒性因子
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S432.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-36
• 1.1 卵菌與寄主植物互作研究14-25
• 1.1.1 病原菌與植物互作的分子基礎(chǔ)14-17
• 1.1.2 卵菌與寄主植物互作進(jìn)展17-23
• 1.1.3 卵菌-擬南芥模式系統(tǒng)23-25
• 1.2 寄生疫霉菌模式系統(tǒng)25-30
• 1.2.1 寄生疫霉菌的系統(tǒng)發(fā)育25
• 1.2.2 寄生疫霉菌的生活史25-26
• 1.2.3 寄生疫霉菌的分子遺傳操作26-28
• 1.2.4 寄生疫霉菌的基因組學(xué)28
• 1.2.5 寄生疫霉菌與擬南芥互作模式系統(tǒng)28-29
• 1.2.6 寄生疫霉菌致病機(jī)制的分子基礎(chǔ)29-30
• 1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)體系在卵菌基因功能分析中的應(yīng)用30-31
• 1.4 蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶31-34
• 1.4.1 蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶的家族成員及其結(jié)構(gòu)31-33
• 1.4.2 蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶的定位33
• 1.4.3 蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶在病原菌侵染中的作用33-34
• 1.5 本研究的目的和意義34-36
• 第二章 擬南芥對(duì)寄生疫霉菌的抗性表型變異和遺傳分析36-55
• 2.1 試驗(yàn)材料36-37
• 2.1.1 菌株36-37
• 2.1.2 植物材料37
• 2.1.3 試劑,儀器37
• 2.2 試驗(yàn)方法37-40
• 2.2.1 植物的種植37
• 2.2.2 寄生疫霉菌的培養(yǎng)37-38
• 2.2.3 接菌方法38
• 2.2.4 細(xì)胞學(xué)觀察38-39
• 2.2.5 胼胝質(zhì)染色39
• 2.2.6 擬南芥的遺傳雜交39
• 2.2.7 SLAF-seq分析RPPAI~(Zu-1)位點(diǎn)39-40
• 2.3 結(jié)果與分析40-52
• 2.3.1 寄生疫霉菌與煙草特異性互作40-41
• 2.3.2 寄生疫霉菌與擬南芥特異性互作41-46
• 2.3.3 擬南芥生態(tài)型Zu-1對(duì)寄生疫霉菌Pp016表現(xiàn)極抗46
• 2.3.4 Zu-1對(duì)寄生疫霉菌具有普遍抗病性46-48
• 2.3.5 細(xì)胞學(xué)觀察Zu-1對(duì)寄生疫霉菌的抗病性48-49
• 2.3.6 寄生疫霉菌能夠侵染Zu-1根部49-50
• 2.3.7 Zu-1對(duì)于寄生疫霉菌抗性的遺傳分析50-52
• 2.3.8 SLAF-seq初步定位RPPAI~(Zu-1)位點(diǎn)52
• 2.4 討論52-55
• 第三章 寄生疫霉菌壞死誘導(dǎo)蛋白PpPDI1在侵染中的作用55-86
• 3.1 試驗(yàn)材料56
• 3.1.1 菌株,質(zhì)粒56
• 3.1.2 植物材料56
• 3.1.3 試劑,儀器56
• 3.2 試驗(yàn)方法56-65
• 3.2.1 寄生疫霉菌侵染煙草cDNA文庫的構(gòu)建56-58
• 3.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)58-60
• 3.2.3 文庫的規(guī)模篩選60
• 3.2.4 寄生疫霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選60-62
• 3.2.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)PpPDI1基因的表達(dá)62-64
• 3.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)寄生疫霉菌生物量64-65
• 3.2.7 細(xì)胞學(xué)觀察65
• 3.3 結(jié)果與分析65-83
• 3.3.1 寄生疫霉菌侵染煙草cDNA文庫的構(gòu)建65-66
• 3.3.2 農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)條件的優(yōu)化66-67
• 3.3.3 高通量篩選cDNA文庫鑒定壞死誘導(dǎo)蛋白67-70
• 3.3.4 PpPDI1在本氏煙上引發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞壞死反應(yīng)70-71
• 3.3.5 PpPDI1在真核生物中具有保守性71-75
• 3.3.6 PpPDI1基因表達(dá)模式分析75-76
• 3.3.7 瞬時(shí)表達(dá)確定PpPDI1誘導(dǎo)壞死的功能區(qū)段76-78
• 3.3.8 基因沉默表明PpPDI1對(duì)于寄生疫霉菌是必需的78-80
• 3.3.9 過表達(dá)PpPDI1-EGFP轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生吸器類似結(jié)構(gòu)80-81
• 3.3.10 寄生疫霉菌侵染本氏煙過程中PpPDI1特異性在吸器累積81-83
• 3.4 討論83-86
• 第四章 結(jié)論與展望86-88
• 4.1 結(jié)論86
• 4.2 創(chuàng)新點(diǎn)86-87
• 4.3 研究展望87-88
• 參考文獻(xiàn)88-103
• 致謝103-104
• 作者簡(jiǎn)介104

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王志強(qiáng);周智敏;郭占云;;蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族的結(jié)構(gòu)與功能[J];生命科學(xué)研究;2009年06期

，

本文編號(hào)：886993