本文關(guān)鍵詞：寄生疫霉菌與寄主植物特異性互作的初步研究

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【摘要】：卵菌是一類形態(tài)上與真菌相似,但在進化關(guān)系上與硅藻和褐藻極為相近的真核微生物。卵菌中包含很多來自植物、動物的病原微生物,其中疫霉屬中一些成員是對植物具有毀滅性的病原菌。由于卵菌獨特的生理生化特性,絕大部分有效的殺菌劑防治卵菌病害效果極差。近年來,卵菌病原菌在遺傳、進化以及與寄主植物互作等方面取得了飛速的進展,極大地推動了對病原菌致病機制和毒性遺傳變異規(guī)律的認識。然而,對卵菌疫霉屬的認識主要集中于少數(shù)一些物種,尤其是寄主范圍較窄的致病疫霉菌和大豆疫霉菌。相比較而言,寄生疫霉菌是典型的土傳病害病原菌,寄主范圍廣泛,在疫霉屬中具有代表性。對寄生疫霉菌與寄主植物互作的分子生物學基礎(chǔ)的研究,有助于全面認識卵菌致病的遺傳學和分子生物學機制,對卵菌病害的防治策略有十分重要的意義。在本研究中,我們旨在以寄生疫霉菌作為模式探索卵菌的致病機制。一方面,我們以實驗室前期建立的寄生疫霉菌侵染模式植物擬南芥的親和互作系統(tǒng)為基礎(chǔ),通過對表型變異的描述明確寄生疫霉菌與擬南芥存在特異性互作,進一步完善該親和互作系統(tǒng)。另一方面,我們嘗試借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達系統(tǒng)進行高通量篩選寄生疫霉菌侵染煙草葉片的c DNA文庫,得到與寄生疫霉菌侵染相關(guān)的致病因子。文庫篩選中,我們鑒定到一個來自寄生疫霉菌的二硫異構(gòu)酶基因Pp PDI1,并通過分析該基因的壞死誘導(dǎo)功能,表達特征、基因沉默以及過表達轉(zhuǎn)化子,旨在揭示Pp PDI1在病原菌生長發(fā)育以及侵染過程中的作用。主要研究結(jié)果如下:1.系統(tǒng)研究了寄生疫霉菌和擬南芥互作的表型變異,主要包括病原菌侵染定殖程度和產(chǎn)孢情況以及寄主植物的抗性反應(yīng)。根部和葉部接菌測試表明,寄生疫霉菌菌株與寄主植物擬南芥生態(tài)型之間存在特異性互作。其中,擬南芥生態(tài)型Zurich(Zu-1)對寄生疫霉菌Pp016表現(xiàn)免疫,并且對于測試的20個多樣性的寄生疫霉菌菌株具有廣譜抗病性。進一步的細胞學觀察表明,病原菌最初侵染的植物表皮細胞發(fā)生快速和劇烈的過敏性細胞壞死反應(yīng),從而抑制了病原菌的侵染。2.遺傳分析表明擬南芥Zu-1對寄生疫霉菌的抗性由半顯性單基因位點控制。將抗病生態(tài)型Zu-1與感病生態(tài)型Landsberg(Ler)進行遺傳雜交,對其后代進行接菌分析,我們發(fā)現(xiàn)F1植株葉片發(fā)黃,病斑擴展受到限制,表現(xiàn)中間型的表型;F2群體出現(xiàn)了分離,且分離比(N:Y:H)接近1:2:1(χ2=0.307,P=0.8578)。遺傳分析數(shù)據(jù)表明擬南芥Zu-1的抗病性可能是由半顯性的單基因位點控制,我們將這個位點定義為RPPA1Zu-1(for Resistance to Phytophthora parasitica 1),并通過Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing(SLAF-seq)測序分析,將該位點初步定位于擬南芥IV染色體7.1-11.2Mb區(qū)域。3.功能篩選鑒定參與植物-寄生疫霉菌互作的關(guān)鍵基因。通過構(gòu)建寄生疫霉菌侵染煙草葉片的高質(zhì)量的c DNA文庫,以植物細胞壞死為表型,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達系統(tǒng)在普通煙草和本氏煙葉片上對文庫進行高通量的篩選,從篩選的16,000個c DNA克隆中,獲得24個具有誘導(dǎo)壞死反應(yīng)活性的候選蛋白。在篩選得到的候選蛋白中,我們對一個來自寄生疫霉菌的二硫異構(gòu)酶蛋白(Pp PDI1)進行了進一步的分析,確認了其在本氏煙的葉片上引發(fā)強烈的壞死反應(yīng)。Pp PDI1包含TRX-like結(jié)構(gòu)域,在真核生物中非常保守。缺失突變體分析表明,Pp PDI第一個TRX-like結(jié)構(gòu)域的催化位點CGHC對誘導(dǎo)植物細胞壞死活性至關(guān)重要。4.初步確認Pp PDI1作為一個毒性因子,在寄生疫霉菌侵染寄主植物過程中發(fā)揮作用。Pp PDI1基因在寄生疫霉菌的所有階段都有表達,但相對于萌發(fā)休止孢階段和侵染早期(36hpi),在侵染后期(60hpi)上調(diào)表達。為了進一步探索Pp PDI1在寄生疫霉菌侵染過程中的作用,我們利用遺傳轉(zhuǎn)化,分別得到基因沉默和過表達的轉(zhuǎn)化子。對基因沉默的轉(zhuǎn)化子進行分析,發(fā)現(xiàn)Pp PDI1的沉默效率非常低,并且該基因的表達水平隨后恢復(fù),表明Pp PDI1的表達受到一定的選擇性,可能是病原菌生長發(fā)育所必需的。對過表達Pp PDI1與EGFP融合的轉(zhuǎn)化子進行分析,發(fā)現(xiàn)在侵染過程中,Pp PDI1在吸器處高度累積。與對照1121相比較,過表達Pp PDI1-EGFP轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的吸器數(shù)量明顯增加。此外,實時定量PCR結(jié)果顯示,過表達的轉(zhuǎn)化子在侵染過程中生物定殖量增多。綜上,我們推測Pp PDI1有可能作為一個毒性因子在寄生疫霉菌侵染寄主植物過程中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：寄生疫霉菌 擬南芥 寄主特異性 遺傳分析 本氏煙 細胞壞死 二硫異構(gòu)酶 吸器 毒性因子
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S432.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文獻綜述13-36
• 1.1 卵菌與寄主植物互作研究14-25
• 1.1.1 病原菌與植物互作的分子基礎(chǔ)14-17
• 1.1.2 卵菌與寄主植物互作進展17-23
• 1.1.3 卵菌-擬南芥模式系統(tǒng)23-25
• 1.2 寄生疫霉菌模式系統(tǒng)25-30
• 1.2.1 寄生疫霉菌的系統(tǒng)發(fā)育25
• 1.2.2 寄生疫霉菌的生活史25-26
• 1.2.3 寄生疫霉菌的分子遺傳操作26-28
• 1.2.4 寄生疫霉菌的基因組學28
• 1.2.5 寄生疫霉菌與擬南芥互作模式系統(tǒng)28-29
• 1.2.6 寄生疫霉菌致病機制的分子基礎(chǔ)29-30
• 1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達體系在卵菌基因功能分析中的應(yīng)用30-31
• 1.4 蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶31-34
• 1.4.1 蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶的家族成員及其結(jié)構(gòu)31-33
• 1.4.2 蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶的定位33
• 1.4.3 蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶在病原菌侵染中的作用33-34
• 1.5 本研究的目的和意義34-36
• 第二章 擬南芥對寄生疫霉菌的抗性表型變異和遺傳分析36-55
• 2.1 試驗材料36-37
• 2.1.1 菌株36-37
• 2.1.2 植物材料37
• 2.1.3 試劑,儀器37
• 2.2 試驗方法37-40
• 2.2.1 植物的種植37
• 2.2.2 寄生疫霉菌的培養(yǎng)37-38
• 2.2.3 接菌方法38
• 2.2.4 細胞學觀察38-39
• 2.2.5 胼胝質(zhì)染色39
• 2.2.6 擬南芥的遺傳雜交39
• 2.2.7 SLAF-seq分析RPPAI~(Zu-1)位點39-40
• 2.3 結(jié)果與分析40-52
• 2.3.1 寄生疫霉菌與煙草特異性互作40-41
• 2.3.2 寄生疫霉菌與擬南芥特異性互作41-46
• 2.3.3 擬南芥生態(tài)型Zu-1對寄生疫霉菌Pp016表現(xiàn)極抗46
• 2.3.4 Zu-1對寄生疫霉菌具有普遍抗病性46-48
• 2.3.5 細胞學觀察Zu-1對寄生疫霉菌的抗病性48-49
• 2.3.6 寄生疫霉菌能夠侵染Zu-1根部49-50
• 2.3.7 Zu-1對于寄生疫霉菌抗性的遺傳分析50-52
• 2.3.8 SLAF-seq初步定位RPPAI~(Zu-1)位點52
• 2.4 討論52-55
• 第三章 寄生疫霉菌壞死誘導(dǎo)蛋白PpPDI1在侵染中的作用55-86
• 3.1 試驗材料56
• 3.1.1 菌株,質(zhì)粒56
• 3.1.2 植物材料56
• 3.1.3 試劑,儀器56
• 3.2 試驗方法56-65
• 3.2.1 寄生疫霉菌侵染煙草cDNA文庫的構(gòu)建56-58
• 3.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達試驗58-60
• 3.2.3 文庫的規(guī)模篩選60
• 3.2.4 寄生疫霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選60-62
• 3.2.5 實時定量RT-PCR檢測PpPDI1基因的表達62-64
• 3.2.6 實時定量PCR檢測寄生疫霉菌生物量64-65
• 3.2.7 細胞學觀察65
• 3.3 結(jié)果與分析65-83
• 3.3.1 寄生疫霉菌侵染煙草cDNA文庫的構(gòu)建65-66
• 3.3.2 農(nóng)桿菌瞬時表達條件的優(yōu)化66-67
• 3.3.3 高通量篩選cDNA文庫鑒定壞死誘導(dǎo)蛋白67-70
• 3.3.4 PpPDI1在本氏煙上引發(fā)強烈的細胞壞死反應(yīng)70-71
• 3.3.5 PpPDI1在真核生物中具有保守性71-75
• 3.3.6 PpPDI1基因表達模式分析75-76
• 3.3.7 瞬時表達確定PpPDI1誘導(dǎo)壞死的功能區(qū)段76-78
• 3.3.8 基因沉默表明PpPDI1對于寄生疫霉菌是必需的78-80
• 3.3.9 過表達PpPDI1-EGFP轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生吸器類似結(jié)構(gòu)80-81
• 3.3.10 寄生疫霉菌侵染本氏煙過程中PpPDI1特異性在吸器累積81-83
• 3.4 討論83-86
• 第四章 結(jié)論與展望86-88
• 4.1 結(jié)論86
• 4.2 創(chuàng)新點86-87
• 4.3 研究展望87-88
• 參考文獻88-103
• 致謝103-104
• 作者簡介104

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王志強;周智敏;郭占云;;蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族的結(jié)構(gòu)與功能[J];生命科學研究;2009年06期

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本文編號：886993