本文關鍵詞：魚類GABA受體與相關藥物作用機理研究及其純化分離

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【摘要】：γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是脊椎動物和無脊椎動物體內重要的抑制性神經遞質,它的傳遞作用是由GABA受體介導的。GABA大部分作用是通過GABAA受體介導的。GABAA受體不僅是治療人的癲癇,失眠,精神分裂癥,酒精中毒,帕金森綜合癥等神經系統(tǒng)疾病的醫(yī)藥作用靶點,而且是氟蟲腈,林丹、硫丹等有機氯類,及阿維菌素類等殺蟲劑的作用靶標。氟蟲腈(Fipronil)是一種高效的的苯基吡唑類殺蟲劑,為GABAA受體拮抗劑,通過作用于GABAA受體,阻斷氯離子通道,導致神經信號的損失、過度興奮及死亡。氟蟲腈對不同生物具有毒性差異,對蠅類、鞘翅目及鱗翅目等系列害蟲具有很高的殺蟲活性,對哺乳動物GABAA受體具有較低的親和力,所以對哺乳動物的毒性非常低。但氟蟲腈對某些非靶標生物,如魚類等水生生物的毒性很高,魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分,因此氟蟲腈對魚類的毒性機理研究及其重要。本論文的主要創(chuàng)新點為:針對氟蟲腈對魚類高毒問題,①本論文首次利用熒光探針法探索了魚類GABAA受體與農藥氟蟲腈及1,4-苯二氮卓類藥物RO7的相互作用;②利用計算機模擬方法研究了氟蟲腈與魚類GABAA受體的相互作用,即采用同源模建的方法構建了斑馬魚α1β2γ2型GABAA受體模型,運用分子對接考察氟蟲腈(及其代謝物)與魚類GABAA受體間的作用模式,闡明了氟蟲腈產生魚毒的機理。③利用生物模板法,合成了粒徑分布1.5μm非磁性及磁性單分散二氧化硅,進一步采用反相懸浮包埋法成功制備瓊脂糖-二氧化硅親和層析載體。④利用氟蟲腈和RO7作為親和配基制成親和層析色譜柱,采用親和層析法初步分離了魚類GABAA受體,探索了兩種親和柱對魚類GABAA受體分離的條件。本論文取得的主要研究結論如下:1)1,4-苯二氮卓藥物制備方面:1,4-苯二氮卓藥物在脊椎動物GABAA受體研究中具有極大的重要性,本課題設計并合成了1,4-苯二氮卓藥物RO7及洗脫劑氟西泮,對其合成條件進行了詳細的探討,中間產物及最終產品的結構均通過核磁共振氫譜,紅外光譜、熔點儀等測試手段確證。2)熒光探針法研究1,4-苯二氮卓藥物與魚類GABAA受體相互作用方面:用異硫氰基熒光素(fitc)標記苯二氮卓化合物ro7制備了ro-fitc(rf)熒光探針,研究了該熒光探針與魚腦內gabaa受體的相互作用,同時研究了gaba對ro7與gabaa受體之間相互作用的影響。結果顯示,所制備的熒光探針rf與魚腦內gabaa受體有特異性結合,ro7與受體的親和解離常數kd值為67±5nmol/l,最大結合量[rt]值為13.8±1.8pmol/mgprotein。gaba能促進ro7與gabaa受體的結合。以上說明魚類gabaa受體與哺乳動物結構和功能上相似。3)熒光探針法研究氟蟲腈與魚類gabaa受體相互作用方面:以異硫氰酸熒光素(fitc)標記氟蟲腈(fipronil)制備了fipronil-fitc(ff)熒光探針,研究了該熒光探針與魚腦內gabaa受體的相互作用。結果顯示,所制備的熒光探針ff與魚腦內gabaa受體有特異性結合,fipronil與受體的親和解離常數kd值為346±6nmol/l,最大結合量[rt]值為40.6±3.5pmol/mgprotein。與哺乳動物相比,fipronil對魚類和昆蟲gabaa受體親和力較高,這可能是fipronil對魚類毒性高于哺乳動物毒性的一方面原因。4)計算機模擬技術研究氟蟲腈與魚類gabaa受體相互作用方面:為了研究氟蟲腈對魚類的毒性機理,采用計算機模擬的方法,以煙堿型乙酰膽堿受體為模板,同源建模構建了斑馬魚α1β2γ2型gabaa受體模型,通過分子對接和分子動力學模擬,考察氟蟲腈(及其代謝物)與gabaa受體間的分子相互作用。發(fā)現氟蟲腈與斑馬魚gabaa受體離子通道內側的2′,6′和9′的氨基酸有強烈的結合作用,其中氟蟲腈苯環(huán)及cf3位于胞內區(qū)一邊,吡唑環(huán)與socf3位于胞外區(qū)一邊,特別是氟蟲腈與6′位親水性氨基酸殘基蘇氨酸形成3條氫鍵,這對與氟蟲腈與魚類gabaa受體的結合非常關鍵,氟蟲腈與魚類gabaa受體間的強烈的氫鍵作用可能是氟蟲腈對魚類產生高毒的原因。同時考察了氟蟲腈在環(huán)境中主要的四種代謝產物與斑馬魚gabaa受體的相互作用,對接顯示四種代謝產物與受體的cdocker相互作用能均比氟蟲腈低,特別是mb46136和fipronil-desulfinyl。說明氟蟲腈代謝產物的對魚類的毒性都強于氟蟲腈,具有較高的環(huán)境風險。以煙堿型乙酰膽堿受體為模板,同時同源建模構建了大鼠α1β2γ2型gabaa受體模型,通過分子對接和分子動力學模擬,發(fā)現氟蟲腈與大鼠gabaa受體僅形成一條氫鍵,而氟蟲腈與斑馬魚gabaa受體6′位親水性氨基酸殘基蘇氨酸形成3條氫鍵,以上從理論上說明了氟蟲腈對魚類高毒而對哺乳動物低毒的原因。5)親和層析載體制備方面:利用生物模板法,合成了粒徑分布1.5μm的單分散性的二氧化硅、實心磁性二氧化硅及空心磁性二氧化硅,并采用反相懸浮包埋法成功制備瓊脂糖-二氧化硅復合粒子。利用四亞甲基乙二醇縮水甘油醚作為環(huán)氧活化劑,用于活化瓊脂糖-二氧化硅復合粒子,最終確定了環(huán)氧活化劑活化介質的最佳反應條件,最終得到介質的環(huán)氧基密度達65.3μmol/g膠,為成功制備分離魚類GABAA受體的親和介質奠定了基礎。6)去污劑對魚類GABAA受體溶出效率方面:在對魚類GABAA受體分離時,比較了4%CHAPS,2%Sodium Deoxycholate,2%OCTG,1%Triton X-100,1%Nonidet P-40及0.5%Lubrol-PX等六種去污劑對GABAA受體蛋白溶出量,結果顯示1%Nonidet P-40對受體蛋白溶出量最高,為729μg/m L。7)親和層析柱的制備及魚類GABAA受體分離方面:分別以氟蟲腈和1,4-苯二氮卓化合物RO7為親和配基,瓊脂糖-二氧化硅復合粒子為載體,制備了兩種親和柱;比較了兩種親和柱分離魚類GABAA受體亞基的區(qū)別,其中經RO7親和柱可分離出4條條帶,分子量分別為56,54,43及37 kD,而氟蟲腈親和柱僅分離出分子量分別為44 kD和55 kD兩條條帶,初步證明苯二氮卓類化合物RO7與氟蟲腈作用于GABAA受體的不同亞基,這是造成氟蟲腈對魚類產生毒性的原因。
【關鍵詞】：γ-氨基丁酸A型受體 氟蟲腈 1 4-苯二氮卓化合物RO7 同源建模 去污劑 生物模板法 瓊脂糖-二氧化硅復合粒子 親和純化
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S941;S482.3
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• Abstract10-15
• 縮略語(Abbreviations)15-17
• 第一章 前言17-21
• 1.1 氟蟲腈對人畜的安全性及對昆蟲的高效性17-18
• 1.2 氟蟲腈對魚類等水生生物的嚴重毒性18
• 1.3 1,4-苯二氮卓類化合物在魚類GABAA受體研究中的應用18
• 1.4 1,4-苯二氮卓化合物在分離哺乳動物GABAA受體的應用18-19
• 1.5 1,4-苯二氮卓化合物熒光探針與哺乳動物GABAA受體相互作用研究19
• 1.6 配體-受體相互作用的計算機模擬19
• 1.7 本課題的研究意義19-21
• 第二章 文獻綜述21-44
• 2.1 GABA受體分類21
• 2.2 GABAA受體的分子結構和分布特點21-24
• 2.2.1 GABAA受體分子結構21-23
• 2.2.2 GABAA受體亞單位及分布23
• 2.2.3 GABAA受體的活性部位23-24
• 2.3 氟蟲腈及對不同生物的毒性差異24-25
• 2.4 GABAA受體與配體的相互作用的研究手段25-35
• 2.4.1 放射性標記法研究受體與配體的相互作用25-28
• 2.4.2 熒光探針法研究受體與配體的相互作用28-31
• 2.4.3 計算模擬技術研究GABAA受體與配體的相互作用31-32
• 2.4.4 相關計算機模擬方法簡介32-35
• 2.4.4.1 同源模建（homology modeling）32-33
• 2.4.4.2 分子動力學33-35
• 2.4.4.3 分子對接35
• 2.5 GABAA受體分離純化研究35-42
• 2.5.1 去污劑對GABAA受體蛋白分離的影響36-39
• 2.5.2 GABAA受體的純化方法39-42
• 2.5.2.1 親和層析法在哺乳動物GABAA受體純化中的應用39-40
• 2.5.2.2 其他分離方法在哺乳動物GABAA受體純化中的應用40-42
• 2.5.2.3 親和層析法在魚類GABAA受體純化中的應用42
• 2.6 小結42-44
• 第三章 設計思想與合成路線44-51
• 3.1 本研究的總體設計思想44-45
• 3.2 1,4-苯二氮卓化合物RO7及洗脫劑合成路線設計45-46
• 3.3 熒光探針合成路線設計46-47
• 3.3.1 1,4-苯二氮卓化合物RO7熒光探針合成路線設計46
• 3.3.2 氟蟲腈熒光探針合成路線設計46-47
• 3.4 計算機模擬技術研究氟蟲腈與魚類GABAA受體的相互作用設計47
• 3.5 親和基質瓊脂糖-二氧化硅親和載體的制備路線設計47-48
• 3.5.1 非磁性二氧化硅微球路線設計47-48
• 3.5.2 實心和空心磁性二氧化硅微球的制備路線設計48
• 3.5.3 瓊脂糖-二氧化硅親和載體制備過程設計48
• 3.6 親和層析介質的制備48-49
• 3.6.1 1,4-苯二氮卓化合物RO7親和層析介質的制備路線設計48-49
• 3.6.2 氟蟲腈親和層析介質的制備路線設計49
• 3.7 魚類GABAA受體的親和分離實驗設計49-51
• 第四章 1,4-苯二氮卓類化合物RO7及氟西泮的合成51-68
• 4.1 實驗部分52-57
• 4.1.1 實驗試劑52
• 4.1.2 實驗儀器與設備52
• 4.1.3 實驗方法52-57
• 4.1.3.1 N-芐氧羰基3碘乙胺的制備52-53
• 4.1.3.2 1,4-苯二氮卓化合物RO7的制備53-56
• 4.1.3.3 1.4-苯二氮卓化合物Ⅱ（氟西泮）的制備56-57
• 4.2 結果與討論57-67
• 4.2.1 化合物最優(yōu)合成條件篩選57-63
• 4.2.1.1 化合物3最優(yōu)制備條件篩選57-58
• 4.2.1.2 化合物4最優(yōu)制備條件篩選58-60
• 4.2.1.3 N-芐氧羰基3碘乙胺最優(yōu)制備條件篩選60-61
• 4.2.1.4 1,4-苯二氮卓化合物RO7鹽酸鹽最優(yōu)制備條件篩選61
• 4.2.1.5 1,4-苯二氮卓化合物Ⅱ氟西泮最優(yōu)制備條件篩選61-63
• 4.2.2 化合物圖譜分析63-67
• 4.2.2.1 N-芐氧羰基3碘乙胺的紅外光譜圖譜分析63-64
• 4.2.2.2 化合物1的紅外光譜圖譜分析64
• 4.2.2.3 化合物2的紅外光譜圖譜分析64-65
• 4.2.2.4 化合物3的紅外光譜圖譜分析65-66
• 4.2.2.5 1,4-苯二氮卓化合物RO7的紅外光譜圖譜分析66-67
• 4.2.2.6 1,4-苯二氮卓化合物氟西泮紅外光譜圖譜分析67
• 4.3 結論67-68
• 第五章 熒光探針法研究 1,4-苯二氮卓化合物與魚類GABAA受體的相互作用68-79
• 5.1 實驗部分69-72
• 5.1.1 實驗動物69
• 5.1.2 實驗試劑69
• 5.1.3 實驗儀器與設備69
• 5.1.4 實驗方法69-72
• 5.1.4.1 RF熒光探針的制備69-70
• 5.1.4.2 組織膜受體制劑的制備70
• 5.1.4.3 熒光配體RF與組織膜受體制劑的結合實驗70-72
• 5.2 結果與討論72-78
• 5.2.1 產物的結構鑒定72
• 5.2.2 光學性能檢測分析72-74
• 5.2.3 不同溶劑體系對熒光配體熒光強度的影響74-75
• 5.2.4 受體與配體結合的動力學分析75-77
• 5.2.5 GABA競爭性結合實驗分析77-78
• 5.3 結論78-79
• 第六章 熒光探針法研究氟蟲腈與魚類GABAA受體的相互作用79-90
• 6.1 實驗部分80-82
• 6.1.1 實驗動物80
• 6.1.2 實驗試劑80
• 6.1.3 實驗儀器與設備80-81
• 6.1.4 實驗方法81-82
• 6.1.4.1 FF熒光探針的制備81
• 6.1.4.2 受體膜制劑的制備81-82
• 6.1.4.3 熒光配體FF與受體膜制劑的結合實驗82
• 6.2 結果與討論82-89
• 6.2.1 產物的結構鑒定82-83
• 6.2.2 光學性能檢測分析83-85
• 6.2.3 不同溶劑體系對熒光配體熒光強度的影響85-86
• 6.2.4 受體與配體結合的動力學分析86-89
• 6.3 結論89-90
• 第七章 計算機模擬技術研究氟蟲腈與魚類GABAA受體的相互作用90-111
• 7.1 實驗部分91-93
• 7.1.1 同源模建91-93
• 7.1.1.1 選擇序列91-92
• 7.1.1.2 選擇模板92
• 7.1.1.3 亞基構建92
• 7.1.1.4 將模型進行有效組合92
• 7.1.1.5 模型的優(yōu)化與修正92
• 7.1.1.6 氟蟲腈與受體模型結合活性.袋的確定92-93
• 7.1.1.7 氟蟲腈及氟蟲腈熒光探針分子與受體模型對接93
• 7.2 結果與討論93-109
• 7.2.1 斑馬魚GABAA受體同源建模93-96
• 7.2.2 氟蟲腈及氟蟲腈熒光探針分子與斑馬魚GABAA受體模型的對接96-100
• 7.2.2.1 氟蟲腈與斑馬魚GABAA受體模型的對接96-98
• 7.2.2.2 氟蟲腈熒光探針分子與受體模型的對接98-100
• 7.2.3 氟蟲腈代謝產物與斑馬魚GABAA受體模型的對接分析100-106
• 7.2.4 氟蟲腈與大鼠GABAA受體相互作用106-109
• 7.2.4.1 哺乳動物大鼠GABAA受體同源建模106-108
• 7.2.4.2 氟蟲腈與大鼠GABAA受體模型的對接108-109
• 7.3 結論109-111
• 第八章 瓊脂糖-二氧化硅親和載體的制備111-134
• 8.1 實驗部分112-116
• 8.1.1 實驗試劑112
• 8.1.2 實驗儀器與設備112
• 8.1.3 實驗方法112-116
• 8.1.3.1 無磁性實心單分散二氧化硅微球的制備112-113
• 8.1.3.2 實心磁性二氧化硅微球的制備113
• 8.1.3.3 空心磁性二氧化硅微球的制備113
• 8.1.3.4 瓊脂糖-二氧化硅復合粒子的制備113-114
• 8.1.3.5 瓊脂糖-二氧化硅復合粒子表面的環(huán)氧化114
• 8.1.3.6 反應溫度對環(huán)氧基密度的影響114
• 8.1.3.7 反應時間對環(huán)氧基密度的影響114
• 8.1.3.8 環(huán)氧活化劑用量對環(huán)氧基密度的影響114-115
• 8.1.3.9 DMSO及NaOH濃度對環(huán)氧基密度的影響115
• 8.1.3.10環(huán)氧基密度的測定115
• 8.1.3.11樣品表征115-116
• 8.2 結果與討論116-133
• 8.2.1 非磁性單分散二氧化硅微球的制備過程116-120
• 8.2.1.1 非磁性二氧化硅微球的形成機理116
• 8.2.1.2 非磁性二氧化硅微球形貌分析116-120
• 8.2.2 磁性二氧化硅微球的制備過程機理分析120-128
• 8.2.2.1 磁性二氧化硅微球形貌及結構表征121-128
• 8.2.3 瓊脂糖-二氧化硅復合粒子的形貌表征128-129
• 8.2.4 瓊脂糖-二氧化硅復合粒子表面瓊脂糖環(huán)氧活化劑活化效率的影響因素分析129-133
• 8.2.4.1 DMSO和NaOH濃度對環(huán)氧活化劑活化率的影響129-130
• 8.2.4.2 反應溫度對環(huán)氧活化劑活化率的影響130-131
• 8.2.4.3 反應時間對環(huán)氧活化劑活化率的影響131-132
• 8.2.4.4 活化劑濃度對環(huán)氧活化劑活化率的影響132
• 8.2.4.5 環(huán)氧基偶聯(lián)密度的確定132-133
• 8.3 結論133-134
• 第九章 親和層析介質的制備及魚類GABAA受體純化分離初探134-153
• 9.1 實驗部分134-144
• 9.1.1 實驗試劑134-135
• 9.1.2 實驗儀器與設備135
• 9.1.3 緩沖液的配制135-136
• 9.1.4 實驗動物136
• 9.1.5 實驗方法136-144
• 9.1.5.1 1,4-苯二氮卓類化合物Ro7親和層析介質的制備136-137
• 9.1.5.2 氟蟲腈親和層析介質的制備137-140
• 9.1.5.2.1 氟蟲腈親和配體的合成137-140
• 9.1.5.3 魚類GABAA受體的親和分離140-144
• 9.2 結果與討論144-152
• 9.2.1 氟蟲腈親和配基的制備及最優(yōu)反應條件的篩選144
• 9.2.2 不同反應因素對環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠氨化率的影響144-145
• 9.2.3 不同反應因素對氟蟲腈親和配基的偶聯(lián)率的影響145
• 9.2.4 RO7及氟蟲腈親和配基偶聯(lián)密度的測定145-146
• 9.2.5 不同去污劑對GABAA受體蛋白溶出量分析146-147
• 9.2.6 苯二氮卓RO7親和層析及離子交換層析分離純化鰱鳙腦內GABAA受體147-150
• 9.2.6.1 分離受體蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳149
• 9.2.6.2 蛋白回收率的計算149-150
• 9.2.7 氟蟲腈親和層析及離子交換層析分離純化鰱鳙腦內GABAA受體150-152
• 9.2.7.1 分離受體蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳151-152
• 9.2.7.2 蛋白回收率的計算152
• 9.3 結論152-153
• 第十章 結論與展望153-156
• 10.1 本論文的主要創(chuàng)新點153
• 10.2 本論文取得的主要研究結論153-155
• 10.3 下一步工作計劃155-156
• 參考文獻156-180
• 致謝180-181
• 附錄181-187
• F-1 合成中間體及目標產物的1H NMR譜圖181-184
• F-2 攻讀博士期間發(fā)表的論文及申請專利184-185
• F-3 攻讀博士期間參與的科研項目185-186
• F-4 攻讀博士期間獲得的獎勵186-187

，

本文編號：883195