本文關鍵詞：香鱗毛蕨4CL基因家族的克隆及功能驗證

  更多相關文章： 香鱗毛蕨 4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL) 功能驗證 遺傳轉化

【摘要】：香鱗毛蕨是多年生藥用真蕨類植物,在我國以黑龍江省為分布中心,特別是五大連池地區(qū)分布面積較大。由于其獨特的生長環(huán)境和生長特點賦予了香鱗毛蕨獨特的藥用價值。香鱗毛蕨作為民間用藥,主要用于治療關節(jié)炎和各種皮膚病,包括銀屑病、痤瘡、皮疹和皮炎等,國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn),香鱗毛蕨還具有較強的驅(qū)蟲、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒等多重作用。迄今為止,一些研究人員主要在形態(tài)解剖學觀察、化學成分的提取分離及藥理活性等方面對香鱗毛蕨進行研究,關于香鱗毛蕨中次生代謝途徑相關酶基因的研究進行的較少。因此,模擬香鱗毛蕨特殊生境的溫光處理對香鱗毛蕨有效成分的積累,并從分子角度闡明其調(diào)控機制,為實現(xiàn)我國野生香鱗毛蕨資源的有效保護和有效成分的可持續(xù)利用提供理論依據(jù),應用前景十分廣闊。在植物體中,包括木質(zhì)素和黃酮類化合物等次級代謝產(chǎn)物都是由苯丙烷類代謝途徑產(chǎn)生的,這些次級代謝產(chǎn)物不但對植物體自身具有重要的作用,而且對人體的健康具有重要作用,因此,苯丙烷代謝途徑及途徑中的關鍵酶成為人們研究的熱點。在這條代謝途徑中,4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)位于主途徑向分支途徑過渡的關鍵點上,控制進入不同的苯丙烷類化合物代謝支路,產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物,并且研究發(fā)現(xiàn)4CL基因?qū)倩蚣易逍问?不同的4CL基因可控制代謝途徑的不同方向,研究4CL基因家族成員對次級代謝產(chǎn)物調(diào)控及次級代謝物質(zhì)的積累有重要意義,也為廣泛研究及應用香鱗毛蕨的次級代謝產(chǎn)物打下堅實基礎。本試驗在前期的溫光誘導香鱗毛蕨轉錄組的測序的研究中,確定苯丙烷類衍生物代謝途徑是香鱗毛蕨黃酮類化合物的重要代謝途徑,這與被子植物的苯丙烷類代謝較為相似。其中,4-香豆酸輔酶A連接酶基因則是這個代謝途徑中的關鍵酶基因。目前,4CL基因在被子植物、裸子植物、苔蘚植物已經(jīng)被廣泛的研究,而對于蕨類植物中則鮮有報道。本研究結合本課題組對香鱗毛蕨轉錄組測序結果的分析,從中篩選出4-香豆酸輔酶A連接酶基因,得到的主要試驗結果如下:1.本研究通過從本組前期試驗獲得溫光處理的香鱗毛蕨轉錄組文庫中篩選并選定Unigene15437_All,Unigene18514_All,Unigene21777_All Unigene32945_All 4條基因,通過序列比對發(fā)現(xiàn),4個基因與已知植物4CL基因具有高度同源性,并以此為核心片段,進行后續(xù)試驗。2.本文中通過RACE技術,將獲得的4個核心片段進行全長的序列擴增,獲得4個全長基因,并將Unigene15437_All,Unigene18514_All,Unigene21777_All Unigene32945_All命名為Df4CL1、Df4CL2、Df4CL3、Df4CL4。進一步研究這四個基因,發(fā)現(xiàn)都具有兩個功能保守域Box I(SSGTTGLPKGV)和Box II(GEICIRG)及底物結合區(qū)Sbd I和Sbd II,并與公開發(fā)表的其他植物中的4CL基因具有高度的一致性。這4個基因之間的一致性為66.00%,編碼分別539、565、552和573個氨基酸,4個基因推測的氨基酸序列之間的一致性為56.59%。確定這4個基因為4-香豆酸輔酶A連接酶基因,并確定為一個基因家族。3.本文運用CHIPS、CUSP和Codon W在線程序?qū)ψ灾骺寺〉南泖[毛蕨4CL基因(Df4CL)序列進行分析,并與大腸桿菌、酵母菌、擬南芥、煙草等基因進行比較,對了解Df4CL基因密碼子使用特性,為其選擇合適的表達系統(tǒng)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),香鱗毛蕨4CL基因?qū)TGC選擇沒有偏向性,并且與小立碗蘚的密碼子使用偏好性相一致。在密碼子使用頻率上,Df4CL基因與擬南芥的差異小于與煙草、大腸桿菌、酵母的差異;基于4CL基因的密碼子使用偏性的系統(tǒng)聚類分析表明,香鱗毛蕨與小立碗蘚、擬南芥聚為一類,因此預示香鱗毛蕨4CL基因更適合在擬南芥中外源表達。4.通過在線軟件等生物信息學方法和手段分析香鱗毛蕨4CL蛋白的情況,研究發(fā)現(xiàn),香鱗毛蕨4CL的4個蛋白均屬于兩性蛋白質(zhì),DF4CL2蛋白無跨膜區(qū),DF4CL1、DF4CL3和DF4CL4蛋白有兩個跨膜區(qū),4個蛋白均無信號肽,并預測了4CL蛋白的高級結構,為今后對該蛋白的結構、功能和可能的酶催化機制、與底物結合位點等相關研究提供重要理論基礎。5.香鱗毛蕨Df4CLs基因組織表達與總黃酮和總木質(zhì)素含量之間基本正相關,在基因表達量高的組織中總黃酮和總木質(zhì)素含量也較高,這說明從香鱗毛蕨中擴增出來的基因Df4CLs參與總黃酮和總木質(zhì)素含量的合成。6.香鱗毛蕨4CL基因的表達還能被溫度激活。在低溫(4℃)或者高溫(35℃)條件下,4個基因都表現(xiàn)為先增大后減少的趨勢,而香鱗毛蕨中黃酮類化合物含量和木質(zhì)素含量變化趨勢與之基本一致,但峰值點不相同,一般而言,黃酮類化合物和總木質(zhì)素含量達到最高點的峰值要比基因滯后,溫度除影響基因的表達量外,還可能影響物質(zhì)合成中酶的活性,導致含量的變化。7.紫外線照射同樣會影響4CL基因及黃酮含量和木質(zhì)素含量。在紫外線照射下,基因Df4CL3和Df4CL4顯著增加,尤其是Df4CL3。而黃酮類化合物增加顯著,木質(zhì)素增加平緩。一般而言,在紫外線照射下,保護植物體防止紫外線輻射的黃酮類物質(zhì)會顯著增加,這與我們得到的試驗結果也相一致。8.本文成功構建了Df4CL2的原核表達體系表達出具有酶活性的重組蛋白,通過表達載體p ET28a-Df4CL2中的HIS標簽成功純化出重組蛋白。9.本文成功構建了植物表達載體pBI121-Df4CL1,通過浸花法對擬南芥野生型植株進行遺傳轉化。利用PCR方法對轉基因植株進行檢測,獲得純合體轉基因植株,并對黃酮化合物和木質(zhì)素含量進行檢測,結果顯示,轉基因植株中的含量明顯高于野生型。
【關鍵詞】：香鱗毛蕨 4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL) 功能驗證 遺傳轉化
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2;S567.239
【目錄】：

• 摘要12-14
• 英文摘要14-17
• 1 引言17-31
• 1.1 香鱗毛蕨的研究概述17-19
• 1.1.1 香鱗毛蕨簡介17
• 1.1.2 香鱗毛蕨藥用價值17-19
• 1.2 苯丙烷衍生物代謝途徑的研究概述19-21
• 1.2.1 苯丙烷類代謝產(chǎn)物在植物體中的作用19-20
• 1.2.2 苯丙烷衍生物代謝途徑20-21
• 1.3 4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL) 研究進展21-24
• 1.3.1 4CL基因家族21-23
• 1.3.2 4CL同工酶研究23-24
• 1.3.3 4CL表達調(diào)控研究24
• 1.4 本實驗中應用的主要技術24-28
• 1.4.1 轉錄組測序技術24-26
• 1.4.2 c DNA末端快速擴增技術(RACE)技術26-27
• 1.4.3 熒光定量PCR技術27-28
• 1.5 本研究目的、意義及技術路線28-31
• 1.5.1 研究目的、意義28-30
• 1.5.2 技術路線30-31
• 2 材料與方法31-56
• 2.1 試驗材料31
• 2.2 香鱗毛蕨 4CL基因家族的克隆31-42
• 2.2.1 植物材料、菌種及質(zhì)粒31
• 2.2.2 主要儀器31-32
• 2.2.3 主要藥品及試劑32
• 2.2.4 緩沖液、主要試劑及培養(yǎng)基的配置32
• 2.2.5 香鱗毛蕨總RNA的提取32-33
• 2.2.6 RNA純度及濃度檢測33
• 2.2.7 香鱗毛蕨c DNA的合成33-34
• 2.2.8 香鱗毛蕨 4CL基因家族的電子克隆34-35
• 2.2.9 香鱗毛蕨 4CL基因家族c DNA 3′ 端片段的克隆35-38
• 2.2.10 香鱗毛蕨 4CL基因家族c DNA 5′端片段的克隆38-40
• 2.2.11 香鱗毛蕨 4CL基因家族開放閱讀框架的克隆40-42
• 2.3 香鱗毛蕨 4CL基因家族的生物信息學分析42
• 2.4 香鱗毛蕨 4CL基因家族的特異性表達42-45
• 2.4.1 不同處理條件下香鱗毛蕨孢子體幼苗的培養(yǎng)42-43
• 2.4.2 香鱗毛蕨孢子體幼苗不同處理條件下RNA的提取43
• 2.4.3 c DNA第一鏈的合成43
• 2.4.4 香鱗毛蕨 4CL基因家族實時熒光定量PCR分析43-44
• 2.4.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析及作圖44-45
• 2.5 香鱗毛蕨總黃酮類化合物和木質(zhì)素含量的測定45-47
• 2.5.1 試驗材料45
• 2.5.2 主要儀器45
• 2.5.3 試驗試劑45
• 2.5.4 香鱗毛蕨黃酮類化合物的測定45-47
• 2.5.5 香鱗毛蕨總木質(zhì)素含量的測定47
• 2.6 香鱗毛蕨 4CL基因家族的原核表達及活性測定47-51
• 2.6.1 菌株和質(zhì)粒47-48
• 2.6.2 原核表達載體構建48-49
• 2.6.3 目的蛋白的誘導表達49-50
• 2.6.4 SDS-PAGE檢測表達蛋白50
• 2.6.5 重組蛋白酶活性測定50-51
• 2.6.6 香鱗毛蕨 4CL2蛋白的純化51
• 2.7 香鱗毛蕨 4CL基因的真核表達及功能驗證51-56
• 2.7.1 菌株及質(zhì)粒51
• 2.7.2 常用試劑及培養(yǎng)基51-52
• 2.7.3 香鱗毛蕨Df4CL1基因植物表達載體的構建52
• 2.7.4 農(nóng)桿菌菌液的制備52-53
• 2.7.5 Df4CL1基因?qū)M南芥的遺傳轉化53-54
• 2.7.6 Df4CL1基因轉基因純合植株的獲得54
• 2.7.7 轉基因擬南芥的PCR鑒定54-55
• 2.7.8 轉基因擬南芥的代謝產(chǎn)物的總黃酮含量和木質(zhì)素含量的測定55-56
• 3 結果與分析56-106
• 3.1 香鱗毛蕨 4CL基因家族的篩選56-57
• 3.2 香鱗毛蕨 4CL基因家族的克隆57-67
• 3.2.1 總RNA的提取57
• 3.2.2 Df4CL1基因全長克隆57-60
• 3.2.3 Df4CL2基因全長克隆60-62
• 3.2.4 Df4CL3基因全長克隆62-64
• 3.2.5 Df4CL4基因全長克隆64-66
• 3.2.6 Df4CL基因家族開放閱讀框架的克隆66-67
• 3.3 香鱗毛蕨 4CL基因家族的核酸序列分析67-78
• 3.3.1 Df4CL基因家族cDNA序列同源性分析67-69
• 3.3.2 Df4CL基因家族密碼子分析69-73
• 3.3.3 Df4CL基因家族表達預測73-78
• 3.3.4 Df4CL基因家族遺傳進化分析78
• 3.4 香鱗毛蕨 4CL基因家族的蛋白序列分析及同源模建78-89
• 3.4.1 Df4CL家族蛋白一級結構的預測及分析78-80
• 3.4.2 Df4CL家族蛋白二級結構的預測及分析80-81
• 3.4.3 Df4CL蛋白疏水性分析81-82
• 3.4.4 Df4CL家族蛋白質(zhì)的信號肽預測82-83
• 3.4.5 Df4CL家族蛋白卷曲螺旋預測分析83-84
• 3.4.6 Df4CL家族蛋白跨膜區(qū)分析84-85
• 3.4.7 Df4CL家族蛋白質(zhì)糖基化位點分析85-86
• 3.4.8 Df4CL家族蛋白磷酸化位點預測86-87
• 3.4.9 Df4CL家族蛋白高級結構的預測及分析87-88
• 3.4.10 Df4CL家族蛋白遺傳進化分析88-89
• 3.5 香鱗毛蕨 4CL基因家族的特異性表達89-92
• 3.5.1 Df4CL基因家族發(fā)育及不同部位的特異性表達89
• 3.5.2 Df4CL基因家族在溫光誘導條件下的特異性表達89-91
• 3.5.3 Df4CL基因家族在紫外條件誘導下的特異性表達91-92
• 3.6 香鱗毛蕨總黃酮類化合物和總木質(zhì)素含量的測定92-95
• 3.6.1 香鱗毛蕨不同部位的總黃酮類化合物含量92
• 3.6.2 香鱗毛蕨溫度誘導條件下的總黃酮類化合物含量92-93
• 3.6.3 香鱗毛蕨紫外誘導條件下的總黃酮類化合物含量93
• 3.6.4 香鱗毛蕨不同部位的總木質(zhì)素含量93-94
• 3.6.5 香鱗毛蕨溫度誘導條件下的總木質(zhì)素含量94-95
• 3.6.6 香鱗毛蕨紫外條件處理下的總木質(zhì)素含量95
• 3.7 香鱗毛蕨 4CL基因家族的原核表達95-100
• 3.7.1 目的片段的擴增95-96
• 3.7.2 雙酶切p ET-28a表達載體和目的基因96
• 3.7.3 p ET-28a表達載體和目的基因的連接96-97
• 3.7.4 SDS-PAGE檢測表達重組蛋白97-98
• 3.7.5 不同IPTG濃度誘導香鱗毛蕨Df4CL2的表達98-99
• 3.7.6 不同IPTG濃度誘導香鱗毛蕨Df4CL2重組蛋白的活性測定99-100
• 3.7.7 Df4CL2重組蛋白的純化100
• 3.8 Df4CL1基因的過表達體的構建及基因的功能驗證100-106
• 3.8.1 含酶切位點的目的片段的擴增100-101
• 3.8.2 表達載體和目的基因的雙酶切、連接及驗證101-102
• 3.8.3 p BI121-Df4CL1轉入農(nóng)桿菌中的驗證102
• 3.8.4 4CL過表達體擬南芥的獲得102-104
• 3.8.5 Df4CL過表達體擬南芥的PCR鑒定104
• 3.8.6 4CL過表達擬南芥的總黃酮含量測定104-105
• 3.8.7 Df4CL1過表達體擬南芥的總木質(zhì)素含量的測定105-106
• 4 討論106-113
• 4.1 香鱗毛蕨 4CL基因家族的篩選106-107
• 4.2 香鱗毛蕨Df4CL基因家族成員的分析107-108
• 4.3 香鱗毛蕨 4CL基因家族的生物信息學分析108-109
• 4.4 香鱗毛蕨 4CL基因家族的原核表達109
• 4.5 香鱗毛蕨 4CL基因家族與總黃酮和木質(zhì)素含量的關系109-113
• 5 結論113-114
• 6 創(chuàng)新點114-115
• 致謝115-116
• 參考文獻116-129
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文129

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 殷冬梅;王允;張幸果;李賀敏;崔黨群;;花生籽仁高通量轉錄組文庫構建與檢測[J];分子植物育種;2015年02期

2 侯佳音;劉淑欣;張瀚文;蔣湘寧;陳雪梅;;HPLC-MSn法檢測毛白楊CCR酶活及反應產(chǎn)物4-羥基肉桂醛類的制備[J];河北農(nóng)業(yè)大學學報;2015年02期

3 凌瑤;高飛;王安虎;李成磊;陳惠;吳琦;;苦蕎4-香豆酸輔酶A連接酶基因(Ft4CL)的克隆及序列分析[J];廣西植物;2015年05期

4 王艷婷;徐正丹;彭良才;;植物細胞壁溝槽結構與生物質(zhì)利用研究展望[J];中國科學:生命科學;2014年08期

5 黃小花;許鋒;程華;李琳玲;程水源;;轉錄組測序在高等植物中的研究進展[J];黃岡師范學院學報;2014年06期

6 Yan Liang;Hai-long Shen;Chun-ping Liu;Ling Yang;Peng Zhang;;Comparison of methods for extracting high-throughput sequencing RNA from Korean pine seeds[J];Journal of Forestry Research;2016年01期

7 楊杰;張瑜;;轉錄組測序技術在整合網(wǎng)絡調(diào)控中的應用現(xiàn)狀及前景[J];生命科學研究;2013年06期

8 陳華;鄧燁;張沖;蔡鐵城;鄭奕雄;莊偉建;;不同發(fā)育時期花生胚混合全長cDNA文庫的構建與分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2014年11期

9 賀凱;楊勇;李樹平;李學剛;;線粒體功能損傷及靶向線粒體的抗氧化和抗癌藥物研發(fā)進展[J];中國新藥與臨床雜志;2014年08期

10 李臻;劉煒;王慶國;張貴林;;黑暗和機械刺激對花生果針中激素含量的影響[J];中國油料作物學報;2014年06期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 李慧;2，，4-二氯苯酚致草魚原代肝臟細胞凋亡及其作用機理研究[D];蘭州大學;2013年

2 李成忠;影響芍藥花莖機械強度的生理機制研究[D];揚州大學;2013年

3 張樹偉;香水檸檬無籽成因和相關基因的分離與鑒定[D];廣西大學;2014年

4 趙海燕;棉花亞棉A細胞質(zhì)雄性不育系的不育機理研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2013年

5 汪波;丹參酚酸和薯蕷皂苷生物合成基因的挖掘與分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

6 O@勝利;能源植物芒草細胞壁結構組成與糖化發(fā)酵關系的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

7 李豐成;植物細胞壁結構特征與生物質(zhì)高效利用分子機理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 范麗;桑樹木質(zhì)素合成基因的生物信息和功能分析[D];西南大學;2013年

2 孫卯;CD44~+胃癌細胞的腫瘤干細胞特性鑒定及其與癌侵襲相關性研究[D];重慶醫(yī)科大學;2013年

3 楊曉云;青稞4-香豆酸輔酶A連接酶基因4CL的克隆及表達分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2013年

4 曹盈;鹽生植物遼寧堿蓬（Suaeda liaotungensis K.）轉錄組測序及分析[D];遼寧師范大學;2013年

5 伍峙亮;小麥細胞壁結構特性與生物質(zhì)降解產(chǎn)糖機理的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

6 徐玉;蜜柚木質(zhì)素合成相關基因的克隆與表達研究[D];福建農(nóng)林大學;2014年

7 高睿;香鱗毛蕨鯊烯合成酶基因的克隆與表達[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2014年

8 蓋慶巖;香鱗毛蕨精油的高效提取及其對油脂氧化穩(wěn)定性的作用[D];東北林業(yè)大學;2014年

9 孫瑤;綿馬素PB體外抗HepG2肝癌細胞的作用機制研究[D];東北林業(yè)大學;2014年

10 孔雪;白樺4CL基因表達載體的構建及遺傳轉化[D];東北林業(yè)大學;2014年

本文編號：834376