本文關(guān)鍵詞：大葉落地生根胎生苗差減cDNA文庫的構(gòu)建及相關(guān)基因的克隆

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【摘要】：大葉落地生根(K. daigremontiana)別名花蝴蝶、倒吊蓮、大還魂,是景天科(Crassulaceae)伽藍菜屬(Kalanchoe adans.)中一種極易栽培的觀賞植物。大葉落地生根的胎生苗無性繁殖過程,同時具有胚胎發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑的特點,由于其不形成種子,而在葉片邊緣形成體細胞胚,為研究體細胞胚發(fā)生途徑、器官發(fā)生途徑和植物體細胞全能性提供了一個良好的模型。因此,本研究以大葉落地生根胎生苗為研究對象,揭示無性繁殖過程中相關(guān)基因的的變化,為進一步闡明大葉落地生根胎生苗無性繁殖的過程提供一個框架和平臺,對深入了解無性繁殖的分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。具體的研究結(jié)果如下：1.通過外施植物激素的方法來確定生長素和細胞分裂素在胎生苗發(fā)生和發(fā)育中的作用。胎生苗是發(fā)生在母葉邊緣鋸齒處2-3 mm范圍內(nèi)的細胞層中,從葉片頂端向葉柄基部逐漸發(fā)生,而且沿著葉片中軸對稱產(chǎn)生。生長素(2,4-D)對胎生苗無性繁殖的影響較小,起關(guān)鍵作用的激素是細胞分裂素(6-BA),用細胞分裂素抑制劑(PR)完全抑制在切割葉片中胎生苗的產(chǎn)生。而且在發(fā)育階段,細胞分裂素處理過的胎生苗葉片直徑明顯大于對照和其他處理。2.通過SSH技術(shù)來尋找差異表達的功能基因,以著生胎生苗的母葉為測試方(tester),不著生胎生苗的母葉為驅(qū)動方(driver),構(gòu)建大葉落地生根胎生苗差減文庫,共富集到481條高質(zhì)量的序列,拼接成390條一致性序列,包括338條單一序列和52條重疊群序列。有132條序列能夠在COG數(shù)據(jù)庫中比對到,分為12個大類。挑選30條基因進行real-time PCR實驗,根據(jù)實驗結(jié)果將這些分為5類,說明在胎生苗發(fā)生發(fā)育過程中的基因表達模式非常復(fù)雜,同時也證明無性繁殖是一個復(fù)雜的基因調(diào)控系統(tǒng),涉及到大量基因的表達水平的變化。3.對差減文庫中的6條基因進行克隆和分析,包括：組氨醇脫氫酶(KdHDH)、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(KdGST)、F-Box家族蛋白(KdF-box)、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(KdSAHH)、谷氨酸脫羧酶(KdGAD)、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(KdCDK)。通過RACE-PCR技術(shù),獲得這6個基因的全長。生物信息學(xué)結(jié)果分析,6個蛋白都沒有信號肽,推測它們都不是分泌蛋白,說明這6個蛋白在細胞內(nèi)起作用。其中,KdSAHH、KdF-box、KdCDK、KdGAD、KdGST是親水性蛋白,KdHDH是疏水性蛋白。KdSAHH、KdF-box、KdCDK、KdGAD、KdHDH是酸性蛋白質(zhì),KdGST是堿性蛋白質(zhì)。其中,大葉落地生根KdHDH基因ORF長為1452 bp,編碼483個氨基酸,具有明顯的疏水區(qū)域和跨膜結(jié)構(gòu),LOCTree軟件預(yù)測定位在葉綠體膜上,與咪唑甘油磷酸脫水酶存在相互作用。大葉落地生根KdGST基因ORF長為1272 bp,編碼423個氨基酸,是一個親水性蛋白,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。大葉落地生根KdGAD基因ORF長為1509 bp,編碼502個氨基酸,分子大小為56.57 kD。沒有明顯的疏水區(qū)域和跨膜結(jié)構(gòu)。LOCTree軟件預(yù)測該蛋白定位在細胞核上。大葉落地生根KdCDK基因ORF長為888 bp,編碼295個氨基酸,是一個親水性蛋白,沒有明顯的跨膜區(qū)域,可能定位在細胞質(zhì)中。大葉落地生根KdF-box基因ORF長為987 bp,編碼328個氨基酸,是親水性蛋白,沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu),定位在細胞質(zhì)中,是非分泌蛋白。大葉落地生根KdSAHH基因ORF長1458 bp,編碼485個氨基酸。沒有明顯的疏水區(qū)域和跨膜結(jié)構(gòu),是一個親水性蛋白質(zhì),定位與細胞質(zhì)中,屬于非分泌蛋白。4. KdSAHH基因在胎生苗無性繁殖過程中上調(diào)表達,差異表達量達到4.08倍,該基因無信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域,說明KdSAHH蛋白是一個廣譜表達而非膜定位的蛋白,與甲基轉(zhuǎn)移酶基因有相互作用,其它有相互作用的蛋白也都與甲基轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此,選擇KdSAHH基因進行深入研究。成功構(gòu)建KdSAHH基因的超表達載體、RNAi載體并轉(zhuǎn)化大葉落地生根和煙草,獲得轉(zhuǎn)化植株。綜上所述,本研究在轉(zhuǎn)錄組水平上對大葉落地生根胎生苗無性繁殖過程進行研究,發(fā)現(xiàn)大量與無性繁殖相關(guān)的基因,通過real-time PCR分析了30個基因的表達模式,通過RACE-PCR克隆出其中6個基因的全長,并進行生物信息學(xué)分析,選擇KdSAHH基因進行下一步研究,構(gòu)建KdSAHH基因的超表達載體、RNAi載體轉(zhuǎn)化大葉落地生根和煙草,并成功獲得轉(zhuǎn)化植株。本研究的發(fā)現(xiàn)為解釋大葉落地生根胎生苗無性繁殖的分子機制提供了基因資源和工作平臺,充實了大葉落地生根的研究資源,是對大葉落地生根處于初級研究階段的填補和充實。
【關(guān)鍵詞】：大葉落地生根 胎生苗 差減雜交 基因克隆 KdSAHH基因
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S682.36
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略詞9-11
• 目錄11-15
• 1 引言15-17
• 2 文獻綜述17-28
• 2.1 大葉落地生根的概況17-19
• 2.1.1 大葉落地生根的來源17-18
• 2.1.2 大葉落地生根的形態(tài)特征18-19
• 2.1.3 大葉落地生根的栽培繁殖管理19
• 2.2 伽藍菜屬的分類情況19-20
• 2.3 大葉落地生根的研究價值20-22
• 2.3.1 觀賞價值20
• 2.3.2 經(jīng)濟價值20
• 2.3.3 教學(xué)價值20-21
• 2.3.4 景天酸代謝(CAM)研究模型21
• 2.3.5 藥用價值21-22
• 2.3.6 抗病蟲價值22
• 2.4 胎生苗模型研究價值22-25
• 2.4.1 胚胎發(fā)生途徑的特征23-24
• 2.4.2 器官發(fā)生途徑的特征24
• 2.4.3 胎生苗發(fā)生發(fā)育過程中基因表達和基因功能24-25
• 2.5 本研究的目的和內(nèi)容25-28
• 2.5.1 研究的目的意義25-26
• 2.5.2 研究內(nèi)容26
• 2.5.3 技術(shù)路線26-28
• 3 生長素和細胞分裂素在大葉落地生根胎生苗發(fā)生發(fā)育過程中的作用28-41
• 3.1 實驗材料及處理28-30
• 3.1.1 實驗材料28
• 3.1.2 植物激素的配置28-29
• 3.1.3 試驗處理29
• 3.1.4 確定胎生苗發(fā)生位置29-30
• 3.1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計30
• 3.2 結(jié)果與分析30-38
• 3.2.1 胎生苗發(fā)生位置30-31
• 3.2.2 不同激素處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗的表型差異31-33
• 3.2.3 以完整葉片作為外植體在不同激素處理下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時間和數(shù)量差異33-35
• 3.2.4 以切割葉片作為外植體在不同激素處理下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時間和數(shù)量差異35-37
• 3.2.5 不同激素處理對胎生苗發(fā)育的影響37-38
• 3.3 討論38-39
• 3.4 小結(jié)39-41
• 4 大葉落地生根胎生苗差減文庫的構(gòu)建及差異基因的表達分析41-63
• 4.1 實驗材料及處理42-44
• 4.1.1 植物材料42
• 4.1.2 主要酶與試劑42
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備42-43
• 4.1.4 常用培養(yǎng)基43
• 4.1.5 Real-time PCR引物的設(shè)計43-44
• 4.2 實驗方法44-46
• 4.2.1 總RNA的提取44
• 4.2.2 mRNA的分離純化44
• 4.2.3 cDNA的合成和RsaI的酶切44
• 4.2.4 SSH差減文庫的構(gòu)建44-45
• 4.2.5 測序和生物信息學(xué)分析45
• 4.2.6 熒光定量PCR分析差異基因的表達45-46
• 4.3 結(jié)果與分析46-59
• 4.3.1 葉片總RNA的完整性及mRNA分離純化46-47
• 4.3.2 最佳循環(huán)數(shù)的優(yōu)化47-48
• 4.3.3 cDNA的純化48-49
• 4.3.4 RsaⅠ酶切后純化效率檢測49-50
• 4.3.5 抑制性差減雜交效率分析50-51
• 4.3.6 差減cDNA文庫的構(gòu)建及陽性克隆的篩選51-52
• 4.3.7 差減文庫的的序列分析52-56
• 4.3.8 差異基因的表達分析56-59
• 4.4 討論59-62
• 4.4.1 葉片總RNA及mRNA的分離純化59-60
• 4.4.2 差減cDNA文庫的可靠性60-61
• 4.4.3 胎生苗無性繁殖過程中涉及到的基因61-62
• 4.5 小結(jié)62-63
• 5 胎生苗無性繁殖中相關(guān)基因的克隆和生物信息學(xué)分析63-106
• 5.1 實驗材料及處理63-64
• 5.1.1 植物材料63
• 5.1.2 主要酶與試劑63-64
• 5.1.3 主要儀器設(shè)備64
• 5.1.4 常用培養(yǎng)基64
• 5.2 實驗方法64-80
• 5.2.1 總RNA的提取64
• 5.2.2 組氨醇脫氫酶(histidinol dehydrogenase；KdHDH)基因的克隆64-71
• 5.2.3 谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase；KdGST)基因的克隆71-72
• 5.2.4 谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase;KdGAD)基因的克隆72-73
• 5.2.5 細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin dependent kinase；KdCDK)基因的克隆73-74
• 5.2.6 F-Box家族蛋白(F-box family protein；KdF-box)基因的克隆74-75
• 5.2.7 S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocystrine hydrolase:KdSAHH)基因的克隆75-79
• 5.2.8 獲得序列的生物信息學(xué)分析79-80
• 5.3 結(jié)果與分析80-104
• 5.3.1 組氨醇脫氫酶(KdHDH)基因克隆與生物信息學(xué)分析80-84
• 5.3.2 谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(KdGST)基因克隆與生物信息學(xué)分析84-88
• 5.3.3 谷氨酸脫羧酶(KdGAD)基因克隆與生物信息學(xué)分析88-92
• 5.3.4 細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(KdCDK)基因克隆與生物信息學(xué)分析92-96
• 5.3.5 F-Box家族蛋白(KdF-box)基因克隆與生物信息學(xué)分析96-100
• 5.3.6 S-腺苷高半胱氨酸水解酶(KdSAHH)基因克隆與生物信息學(xué)分析100-104
• 5.4 討論104-105
• 5.5 小結(jié)105-106
• 6 大葉落地生根KdSAHH基因?qū)煵莺痛笕~落地生根的轉(zhuǎn)化106-124
• 6.1 實驗材料及處理107-108
• 6.1.1 植物材料107
• 6.1.2 主要酶與試劑107
• 6.1.3 植物表達載體107
• 6.1.4 主要設(shè)備107
• 6.1.5 主要培養(yǎng)基107-108
• 6.2 實驗方法108-117
• 6.2.1 KdSAHH基因超表達載體的構(gòu)建108-111
• 6.2.2 KdSAHH基因全長RNAi載體的構(gòu)建111-116
• 6.2.3 KdSAHH基因保守區(qū)RNAi載體的構(gòu)建116
• 6.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化鑒定116
• 6.2.5 植物表達載體轉(zhuǎn)化大葉落地生根116-117
• 6.2.6 植物表達載體轉(zhuǎn)化煙草117
• 6.3 結(jié)果與分析117-122
• 6.3.1 尤基因超表達載體的構(gòu)建117-118
• 6.3.2 基因全長RNAi載體的構(gòu)建118-119
• 6.3.3 足基因保守區(qū)RNAi載體的構(gòu)建119-120
• 6.3.4 植物表達載體轉(zhuǎn)化大葉落地生根120-121
• 6.3.5 植物表達載體轉(zhuǎn)化煙草121-122
• 6.4 討論122-123
• 6.5 小結(jié)123-124
• 7 結(jié)論與展望124-127
• 7.1 結(jié)論124
• 7.2 創(chuàng)新點124-125
• 7.3 展望125-127
• 參考文獻127-135
• 附圖135-136
• 個人簡介136-137
• 獲得成果目錄137-138
• 導(dǎo)師簡介138-139
• 致謝139-14

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1 張守琪;胡相偉;李毅;;大葉落地生根的組織培養(yǎng)和植株再生[J];植物生理學(xué)通訊;2007年04期

2 ;[J];;年期

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1 王一U，

本文編號：826205