發(fā)布時(shí)間：2017-08-26 12:13

  本文關(guān)鍵詞：MiR-27a-3p對(duì)黑色素生成的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： miR-27a-3p Wnt3a 黑色素生成 Tyrp2啟動(dòng)子

【摘要】：哺乳動(dòng)物毛色調(diào)控是一個(gè)由多基因調(diào)控的復(fù)雜的過程,主要由黑色素的合成和分布決定,而黑色素是由黑色素細(xì)胞中的黑素體合成的。Tyrp2是黑色素生成的關(guān)鍵酶酪氨酸酶蛋白家族的第3個(gè)成員,具有多巴色素異構(gòu)酶(DT)的活性,催化多巴色素轉(zhuǎn)變?yōu)?,6-二羥基吲哚羧酸(DHICA),加速黑色素生成的作用。相對(duì)于基因的調(diào)控研究,關(guān)于miRNAs對(duì)黑色素生成調(diào)控的研究較少。miRNAs通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制靶基因的翻譯,參與細(xì)胞發(fā)生、增殖、分化、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移等多個(gè)生物學(xué)過程,甚至黑色素生成。研究miRNAs的功能,關(guān)鍵是確定miRNAs的靶基因。目前,miRNAs靶基因的確定方法主要通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了確定miR-27a-3p對(duì)小鼠黑色素生成的影響及其作用機(jī)制、miR-27a-3p對(duì)綿羊黑色素生成的影響以及為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尋找黑色素細(xì)胞特異性啟動(dòng)子,本實(shí)驗(yàn)通過不同的生物信息學(xué)軟件對(duì)小鼠miR-27a-3p靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),構(gòu)建靶基因3’UTR雙熒光報(bào)告載體和miR-27a-3p過表達(dá)載體；共轉(zhuǎn)染HEK 293 T細(xì)胞驗(yàn)證miRNAs和靶基因的互作關(guān)系；并對(duì)不同毛色小鼠皮膚中miR-27a-3p及其靶基因Wnt3a的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。通過向小鼠黑色素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-27a-3p mimic, inhibitor及其相應(yīng)的NC,并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-27a-3p和Wnt3a mRNA表達(dá)量、Wnt3a蛋白表達(dá)量以及黑色素含量,從而進(jìn)一步確定miR-27a-3p在黑色素生成中的功能。根據(jù)NCBI上的綿羊的Tyrp2基因序列,尋找其啟動(dòng)子區(qū)域,構(gòu)建真核表達(dá)載體,測(cè)序并分析啟動(dòng)子調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。將不同片段長(zhǎng)度的Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊黑色素細(xì)胞,尋找表達(dá)啟動(dòng)子活性最好的Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū),并將綿羊pri-miR-27a連接到該真核表達(dá)載體的Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)下游,將該pri-miR-27a真核表達(dá)載體及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染綿羊黑色素細(xì)胞,并檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組綿羊黑色素細(xì)胞中的miR-27a-3p的表達(dá)量。結(jié)果如下：1、三個(gè)miRNAs數(shù)據(jù)庫(kù)均預(yù)測(cè)Wnt3a為miR-27a-3p的靶基因,Wnt3a3'UTR雙熒光報(bào)告載體和miR-27a-3p真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK 293 T細(xì)胞組的熒光活性降低41%。2、miR-27a-3p mimic、inhibitor及其NC轉(zhuǎn)染小鼠黑色素細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染mimic的黑色素細(xì)胞中miR-27a-3p的表達(dá)量極顯著高于其他組,而Wnt3a mRNA的表達(dá)量在各組之間差異不顯著,最后,miR-27a-3p顯著抑制Wnt3a蛋白的表達(dá)。3、綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)片段為834 bp的區(qū)域啟動(dòng)子活性最好。4、轉(zhuǎn)染pri-miR-27a的綿羊黑色素細(xì)胞中,miR-27a-3p的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。5、轉(zhuǎn)染pri-miR-27a的綿羊黑色素細(xì)胞中,黑色素含量顯著低于對(duì)照組。本研究證明Wnt3a為miR-27a-3p的靶基因,并且miR-27a-3p通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Wnt3a的表達(dá),從而抑制黑色素生成；miR-27a抑制綿羊黑色素生成。
【關(guān)鍵詞】：miR-27a-3p Wnt3a 黑色素生成 Tyrp2啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.2
【目錄】：

• 摘要8-10
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述10-29
• 第一章 哺乳動(dòng)物毛色生成及調(diào)控機(jī)制10-21
• 1 黑色素生成過程及機(jī)制10-12
• 2 黑色素生成的調(diào)控12-17
• 3 黑色素生成涉及的細(xì)胞通路17-21
• 3.1 干細(xì)胞因子(SCF)和它的受體17-19
• 3.2 Wnt通路19
• 3.3 α-MSH/MC1R通路19-20
• 3.4 內(nèi)皮素通路20-21
• 第二章 miRNAs與毛色調(diào)控21-26
• 1 miRNA與毛色調(diào)控21-22
• 2 MiR-27a的功能研究22-26
• 第三章 黑色素細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的研究進(jìn)展26-29
• 1 啟動(dòng)子26
• 2 黑色素細(xì)胞特異性啟動(dòng)子26-29
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)29-85
• 第一章 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和篩選miR-27a-3p靶基因及其驗(yàn)證29-52
• 1 材料與方法29-42
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料29
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材29-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法30-42
• 2 結(jié)果42-49
• 2.1 miR-27a-3p的靶基因預(yù)測(cè)42
• 2.2 小鼠皮膚總RNA純度及完整性的鑒定42-43
• 2.3 小鼠尾部基因組DNA純度及完整性鑒定43
• 2.4 miR-27a真核表達(dá)載體的構(gòu)建43-45
• 2.5 pmirGLO-Wnt3a 3’UTR的構(gòu)建45
• 2.6 pmirGLO-Wnt3a 3’UTR突變及測(cè)序45-47
• 2.7 雙熒光素報(bào)告載體與miRNAs真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK 293 T細(xì)胞及熒光活性檢測(cè)47-49
• 2.8 miR-27a-3p及其靶基因Wnt3a的內(nèi)源性表達(dá)49
• 3 討論49-51
• 4 結(jié)論51-52
• 第二章 miR-27a-3p對(duì)Wnt3a基因表達(dá)及黑色素生成的影響52-61
• 1 材料和方法52-56
• 1.1 實(shí)驗(yàn)樣本52-53
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法53-56
• 2 結(jié)果56-58
• 2.1 小鼠黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察56-57
• 2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-27a-3p和Wnt3a mRNA的表達(dá)水平57-58
• 2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Wnt3a蛋白的表達(dá)水平58
• 2.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中黑色素含量58
• 3 討論58-60
• 4 結(jié)論60-61
• 第三章 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建61-71
• 1 材料與方法61-64
• 1.1 動(dòng)物材料和質(zhì)粒載體61
• 1.2 主要儀器設(shè)備及試劑61-62
• 1.3 引物設(shè)計(jì)62
• 1.4 綿羊皮膚基因組DNA提取62
• 1.5 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增62-63
• 1.6 PCR產(chǎn)物的純化與克隆63
• 1.7 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)真核表達(dá)載體的構(gòu)建63-64
• 2 結(jié)果64-68
• 2.1 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果64
• 2.2 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)克隆結(jié)果64-65
• 2.3 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)真核表達(dá)載體的構(gòu)建65-67
• 2.4 綿羊Tyrp 2基因5’調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)67-68
• 3 討論68-70
• 4 結(jié)論70-71
• 第四章 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)活性驗(yàn)證71-76
• 1 材料與方法71-72
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料71
• 1.2 主要儀器設(shè)備和試劑71-72
• 1.3 綿羊黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)72
• 1.4 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊黑色素細(xì)胞72
• 2 結(jié)果72-73
• 2.1 轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化72-73
• 2.2 綿羊Tyrp2基因5’調(diào)控區(qū)活性驗(yàn)證73
• 3 討論73-75
• 4 結(jié)論75-76
• 第五章 綿羊Tyrp2啟動(dòng)子起始的pri-miR-27a表達(dá)對(duì)黑色素生成的影響76-85
• 1 材料與方法76-79
• 1.1 動(dòng)物材料和質(zhì)粒載體76
• 1.2 主要儀器設(shè)備及試劑76-77
• 1.3 引物設(shè)計(jì)77
• 1.4 綿羊耳組織基因組DNA提取77
• 1.5 綿羊pri-miR-27a的PCR擴(kuò)增77-78
• 1.6 綿羊miR-27a真核表達(dá)載體的構(gòu)建78-79
• 1.7 綿羊黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染79
• 1.8 綿羊黑色素細(xì)胞總RNA提取及cDNA的合成79
• 1.9 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-27a-3p表達(dá)水平的檢測(cè)79
• 1.10 轉(zhuǎn)染后綿羊黑色素細(xì)胞中黑色素含量檢測(cè)79
• 2 結(jié)果79-83
• 2.1 綿羊耳組織基因組DNA的提取與鑒定79-80
• 2.2 pri-miR-27a PCR結(jié)果80
• 2.3 載體及PCR產(chǎn)物酶切回收80
• 2.4 重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證80-81
• 2.5 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果81
• 2.6 轉(zhuǎn)染效率81-82
• 2.7 轉(zhuǎn)染后miR-27a-3p在綿羊黑色素細(xì)胞中的表達(dá)水平82-83
• 2.8 黑色素含量測(cè)定83
• 3 討論83-84
• 4 結(jié)論84-85
• 參考文獻(xiàn)85-93
• 全文總結(jié)93-94
• 研究創(chuàng)新與展望94-96
• Abstract96-98
• 中英文對(duì)照及縮寫表98-100
• 附錄 真核表達(dá)載體構(gòu)建流程圖100-102
• 博士期間發(fā)表論文102-104
• 致謝104

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 趙園園;MiR-27a-3p對(duì)黑色素生成的作用及機(jī)制研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：741431