本文關(guān)鍵詞：抑制素A對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖和卵母細(xì)胞體外成熟的影響

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【摘要】：抑制素（inhibin）是由雌性動(dòng)物卵巢和雄性動(dòng)物睪丸分泌的糖蛋白異二聚體，屬于TGFβ超家族一員，α (INHA)和βA（INHβA）亞基構(gòu)成抑制素A，α和βB (INHβB)形成抑制素B。在雌性動(dòng)物體內(nèi)，抑制素主要通過內(nèi)分泌途徑抑制垂體合成和分泌FSH，調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、配子發(fā)生和激素分泌。在卵巢局部，抑制素還可以通過自分泌和旁分泌作用調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞同步發(fā)展。動(dòng)物發(fā)情周期中，外周血液抑制素水平可以反應(yīng)出卵巢上生長卵泡的數(shù)量，是決定動(dòng)物卵泡發(fā)育和排卵的關(guān)鍵因素。目前關(guān)于抑制素對(duì)動(dòng)物生殖影響的研究主要集中在利用抑制素進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，而對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡影響的研究則主要集中在生殖腫瘤細(xì)胞上。抑制素對(duì)不同動(dòng)物或細(xì)胞的激素分泌影響不一致，對(duì)家畜卵母細(xì)胞成熟研究較少，尤其在豬的研究尚未見報(bào)道。本研究以成年豬卵巢為材料，以卵泡顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)行卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)、卵母細(xì)胞體外成熟、孤雌激活和早期胚胎發(fā)育等一系列實(shí)驗(yàn)，探討抑制素A對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞類固醇激素合成、顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、卵母細(xì)胞成熟的影響，另外還研究抑制素α亞基基因多態(tài)性與豬卵泡囊腫之間的聯(lián)系。研究內(nèi)容主要有以下幾個(gè)方面： 1.抑制素A對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞類固醇激素合成的影響 本研究分離豬卵泡顆粒細(xì)胞，利用FSHR進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。免疫熒光結(jié)果顯示：分離得卵泡顆粒細(xì)胞純度在90%以上，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。然后分別使用不同濃度（0、10、100、200ng/mL）的人源重組抑制素A和400ng/mL的抑制素α抗體處理體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞，處理時(shí)間分為4個(gè)梯度，即12、24、48和72h。處理結(jié)束后提取RNA進(jìn)行熒光定量。熒光定量結(jié)果顯示，200ng/mL的抑制素A處理顆粒細(xì)胞48h，顯著增加了顆粒細(xì)胞內(nèi)FSHR、LHR、CYP11a1和STAR基因mRNA的表達(dá)(p0.05)。ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中孕酮和雌二醇的濃度，結(jié)果顯示，200ng/mL抑制素A作用48h顯著提高了顆粒細(xì)胞中雌二醇的合成及分泌（p0.05）。200ng/mL抑制素A處理顆粒細(xì)胞24h-48h可以顯著抑制孕酮的分泌(p0.05)，72h則表現(xiàn)為促進(jìn)作用（p0.05）。 2.抑制素A對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響 為了研究抑制素A對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響，在豬卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度（0、20、50、100ng/mL）的人源重組抑制素A處理顆粒細(xì)胞24h，MTS檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示：高濃度（50、100ng/mL）的抑制素A可以顯著提高顆粒細(xì)胞活力(p0.05)，并且呈劑量依賴效應(yīng)。利用JC-1方法檢測(cè)線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)100ng/mL抑制素A處理48h可以顯著提高線粒體膜電位。之后，我們研究了抑制素A對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡基因表達(dá)影響，分別利用不同濃度（0、10、100、200ng/mL）的抑制素A處理顆粒細(xì)胞12、24、48、72h，提取RNA后進(jìn)行熒光定量。結(jié)果顯示：抑制素A處理48h可以促進(jìn)增殖基因PCNA、CCNB1的表達(dá)，抑制凋亡基因Caspase-3表達(dá)（p0.05），并且呈劑量依賴效應(yīng)。細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，200ng/mL的抑制素A處理48h可以顯著提高S期細(xì)胞比例（p0.05）。利用RNA干擾方法沉默顆粒細(xì)胞內(nèi)抑制素α亞基基因表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3基因的表達(dá)量升高，，而細(xì)胞周期蛋白CCNB1基因表達(dá)量則降低（p0.05）。這些結(jié)果說明抑制素A可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。 3.抑制素A對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響 為了研究抑制素A對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響，在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加200ng/mL的抑制素A，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，抑制素A可以促進(jìn)GV期GDF9、COX2基因的表達(dá)（p0.05），并能夠促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散和卵母細(xì)胞成熟。體外成熟液或胚胎發(fā)育液中添加抑制素A，可以提高豬卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎的卵裂率（p0.05）,但是對(duì)囊胚率影響不顯著（p0.05）。 4.抑制素α亞基基因多態(tài)性與豬卵泡囊腫之間的聯(lián)系 利用PCR-SSCP與PCR-RFLP方法，檢測(cè)患有卵泡囊腫母豬和正常母豬抑制素α亞基基因c.-42GA和c.3222GA位點(diǎn)基因多態(tài)性與卵泡囊腫之間的聯(lián)系。結(jié)果顯示c.-42GA和c.3222GA多態(tài)性與卵泡囊腫存在聯(lián)系（p0.05），c.-42GG和c.3222GG基因型母豬患囊腫的風(fēng)險(xiǎn)較低。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示囊腫卵泡液中含有高濃度的抑制素A。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明抑制素A能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞類固醇激素合成分泌，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。抑制素A還可以促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟，促進(jìn)孤雌激活胚胎的卵裂，但是對(duì)早期胚胎發(fā)育的囊胚率影響不顯著。另外抑制素α亞基與豬卵泡囊腫存在聯(lián)系。
【關(guān)鍵詞】：抑制素A 卵泡顆粒細(xì)胞 增殖 卵母細(xì)胞成熟
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S814.1
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 中英文對(duì)照表12-14
• 前言14-16
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述16-30
• 第一章 抑制素分子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理16-22
• 1.1 抑制素的發(fā)現(xiàn)16
• 1.2 抑制素分子結(jié)構(gòu)16
• 1.3 抑制素在體內(nèi)分布16-17
• 1.4 抑制素表達(dá)調(diào)控17-19
• 1.5 抑制素作用機(jī)理19-20
• 1.6 影響抑制素作用的因素20-22
• 第二章 抑制素與雌性動(dòng)物生殖生理22-30
• 2.1 抑制素對(duì)卵泡發(fā)育影響22-24
• 2.2 抑制素對(duì)排卵影響24
• 2.3 抑制素與黃體形成和消融24-25
• 2.4 抑制素與卵母細(xì)胞成熟25-26
• 2.5 抑制素與妊娠26
• 2.6 抑制素與激素分泌26-28
• 2.7 抑制素與乳腺上皮28
• 2.8 抑制素與生殖系統(tǒng)疾病28-29
• 2.9 抑制素在雌性動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用29-30
• 第二篇 研究內(nèi)容30-92
• 第一章 抑制素 A 對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌的影響30-48
• 1.1 材料30-32
• 1.2 方法32-39
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-45
• 1.4 討論45-47
• 1.5 小結(jié)47-48
• 第二章 抑制素 A 對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響48-70
• 2.1 材料48-49
• 2.2 方法49-57
• 2.3 結(jié)果57-66
• 2.4 討論66-68
• 2.5 小結(jié)68-70
• 第三章 抑制素 A 對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育的影響70-82
• 3.1 材料70-71
• 3.2 方法71-75
• 3.3 結(jié)果75-78
• 3.4 討論78-80
• 3.5 小結(jié)80-82
• 第四章 抑制素α亞基基因多態(tài)性與母豬卵泡囊腫的研究82-92
• 4.1 材料82-83
• 4.2 方法83-85
• 4.3 結(jié)果分析85-89
• 4.4 討論89-90
• 4.5 小結(jié)90-92
• 結(jié)論92-94
• 參考文獻(xiàn)94-108
• 導(dǎo)師簡介108-110
• 作者簡介110-112
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文及研究成果112-116
• 致謝116

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：723865