本文關(guān)鍵詞：茉莉酸信號途徑參與調(diào)控沉香倍半萜生物合成的分子機制研究

  更多相關(guān)文章： 白木香 沉香 倍半萜 JA信號途徑 調(diào)控機制

【摘要】：茉莉酸(JA)及其衍生物統(tǒng)稱為茉莉素(JAs),廣泛存在于植物中的一類植物內(nèi)源激素,對植物生長和發(fā)育具有廣泛的生理效應(yīng)；同時可作為內(nèi)源信號分子參與植物的抗逆反應(yīng)。長期以來,對JA信號途徑的機制及功能的研究一直是生命科學研究的熱點之一。白木香(Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg)為瑞香科(Thymelaeceae)沉香屬(Aquilaria)或擬沉香屬(Gyrinops)常綠喬木,是我國生產(chǎn)傳統(tǒng)名貴中藥材沉香的基原植物,同時也是中藥沉香的正品來源。作為傳統(tǒng)中藥,沉香具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效。白木香只有在受到傷害時才能形成沉香,我們已證明了沉香是白木香防御反應(yīng)的產(chǎn)物。沉香主要由倍半萜類和苯乙基色酮類衍生物兩種類型的化合物組成。其中,倍半萜類化合物的生物合成途徑研究相對比較清晰,但對于它的調(diào)控途徑不清楚。前期研究中發(fā)現(xiàn),外源茉莉酸甲酯(MeJA)能顯著誘導(dǎo)白木香樹和愈傷組織中沉香倍半萜物質(zhì)的合成與積累。這些結(jié)果表明,JA與沉香倍半萜的形成有關(guān)；但它是否直接參與調(diào)控以及如何調(diào)控沉香倍半萜的生物合成還不清楚。本文從分子層面上研究JA信號途徑與沉香倍半萜形成的關(guān)系,為揭示白木香結(jié)香機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究獲得了以下主要結(jié)果：1、JA信號分子能調(diào)控沉香倍半萜的合成。結(jié)合白木香轉(zhuǎn)錄組基因表達譜數(shù)據(jù)與熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測分析,發(fā)現(xiàn)JA信號途徑中的關(guān)鍵基因顯著響應(yīng)外界脅迫,且均屬于響應(yīng)早期傷害的基因。熱激處理能誘導(dǎo)白木香懸浮細胞中內(nèi)源激素JA和沉香倍半萜(a-愈創(chuàng)木烯,α-蛇麻烯和δ-愈創(chuàng)木烯)的快速大量合成；JA合成抑制劑能抑制JA和倍半萜的合成,在熱處理后12h以內(nèi)未檢測到沉香倍半萜成分,24 h后才檢測到少量倍半萜生成。2、首次從白木香中,也是沉香屬植物中分離并克隆了JA信號途徑中的5個關(guān)鍵基因(LOX、CPI1、NINJA、JAZ和MYC2) 的 cDNA全長序列。分別命名為,AsLOX1、AsCOI1、AsNINJA1、AsJAZ1和AsMYC2,為倍半萜合成過程中JA信號途徑的研究奠定基礎(chǔ)。3、基本明確了白木香AsJAZ1基因功能,過表達AsJAZ1基因能抑制擬南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPSll的表達,該基因極有可能是調(diào)控沉香倍半萜合酶基因表達的負調(diào)控因子之一。通過亞細胞定位分析,AsJAZ1基因編碼的蛋白定位于細胞核中,屬于核蛋白；基因組織表達模式分析表明,該基因在根、莖、葉和枝中均有表達,但以葉中的表達量最高。將白木香AsJAZ1基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中,該基因過表達抑制了擬南芥中TPS21和TPS11基因的表達。4、基本明確了白木香AsMYC2基因功能,AsMYC2基因過表達能正調(diào)控擬南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11的表達,該基因極有可能是調(diào)控沉香倍半萜合酶基因表達的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。亞細胞定位分析表明,AsMYC2基因編碼的蛋白定位于細胞核中,屬于核蛋白；基因組織表達模式分析表明,該基因在根、莖、葉和枝中均有表達,但以莖和根中的表達量最高；AsMYC2基因過表達能正調(diào)控野生型擬南芥倍半萜合酶基因：VPS21和TPS11的表達；在擬南芥myc2-2突變體中,AsMYC2基因過表達能一定程度上恢復(fù)對TPS21和TPS11基因表達的調(diào)控作用。5.明確了白木香AsJAZ1與AsMYC2白間存在體外相互作用。通過基因重組技術(shù),成功的構(gòu)建了AsJAZl基因和AsMYC2基因的原核表達載體,在大腸桿菌中成功的誘導(dǎo)了His-AsJAZ1(?)GST-AsMYC2融合蛋白的表達,并進行了蛋白純化,高質(zhì)量蛋白的獲得為今后蛋白多克隆抗體的制備提供材料基礎(chǔ)。利用pull-down技術(shù)驗證了兩蛋白間相互作用,為研究JA信號途徑參與調(diào)控沉香倍半萜的生物合成機制奠定基礎(chǔ)。通過研究基本證實了JA信號途徑參與沉香倍半萜生物合成的調(diào)控過程。本研究也是首次在沉香屬植物中,針對沉香倍半萜生物合成調(diào)控機制上開展的關(guān)于JA信號分子通路較系統(tǒng)的研究,將對其它信號分子通路的研究有參考價值,為全面解析傷害誘導(dǎo)白木香防御反應(yīng)形成沉香的調(diào)控機制提供分子依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：白木香 沉香 倍半萜 JA信號途徑 調(diào)控機制
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S567.19
【目錄】：

• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 縮略詞表15-17
• 文獻綜述17-27
• 1 植物防御反應(yīng)的研究進展17-18
• 2 茉莉酸在植物傷信號傳遞中的作用18-22
• 2.1 茉莉酸信號的感知18
• 2.2 茉莉酸類化合物的合成18-19
• 2.3 植物傷信號茉莉酸的傳遞19-21
• 2.4 茉莉酸信號分子與其他信號分子在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的交叉作用21-22
• 3 JA在傷害脅迫下對植物次生代謝物合成的調(diào)控作用22-24
• 3.1 尼古丁23
• 3.2 長春花堿23
• 3.3 青蒿素23
• 3.4 硫代葡萄糖甙/亞麻薺素23
• 3.5 花青素23-24
• 3.6 芐基異喹啉生物堿24
• 4 沉香的研究進展24-27
• 4.1 沉香形成的機理24-25
• 4.2 沉香的化學成分25
• 4.3 沉香的結(jié)香方法25-27
• 前言27-39
• 技術(shù)路線圖28-29
• 參考文獻29-39
• 第一章 茉莉酸信號分子與沉香倍半萜形成的相關(guān)性研究39-57
• 1 實驗材料39-40
• 1.1 試劑39
• 1.2 儀器39-40
• 1.3 植物材料40
• 1.4 實驗所用引物的設(shè)計與合成40
• 2 實驗方法40-44
• 2.1 實驗材料處理40-41
• 2.2 內(nèi)源茉莉酸的測定41-42
• 2.3 倍半萜的測定42
• 2.4 茉莉酸信號通路中核心基因的表達分析42-44
• 2.4.1 總RNA的提取42-43
• 2.4.2 DNase Ⅰ消化總RNA43
• 2.4.3 cDNA第一鏈的合成43-44
• 2.4.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)44
• 3 實驗結(jié)果44-53
• 3.1 基于轉(zhuǎn)錄組學茉莉酸信號通路中核心基因的表達譜44-46
• 3.2 熱激處理對白木香懸浮細胞中內(nèi)源茉莉酸含量的影響46-48
• 3.3 熱激處理對白木香懸浮細胞中倍半萜含量的影響48-49
• 3.4 傷害脅迫下茉莉酸信號通路中核心基因的表達49-53
• 4 討論53-54
• 5 本章小結(jié)54
• 參考文獻54-57
• 第二章 茉莉酸信號通路中關(guān)鍵基因全長cDNA克隆與生物信息學分析57-81
• 1 實驗材料57-58
• 1.1 試劑57-58
• 1.2 儀器58
• 1.3 材料58
• 1.3.1 植物材料58
• 1.3.2 菌株與載體58
• 1.4 實驗所用引物的設(shè)計與合成58
• 2 實驗方法58-64
• 2.1 總RNA的提取58
• 2.2 mRNA的分離與純化58-60
• 2.3 5'和3'cDNA第一鏈的合成60-61
• 2.3.1 5'cDNA第一鏈的合成60
• 2.3.2 3'cDNA第一鏈的合成60-61
• 2.4 cDNA第一鏈的合成61
• 2.5 基因cDNA序列全長的克隆61-64
• 2.5.1 5'和3'cDNA的擴增61-62
• 2.5.2 PCR產(chǎn)物檢測與回收62-63
• 2.5.3 連接、轉(zhuǎn)化與測序63-64
• 2.6 生物信息學分析及進化樹的構(gòu)建64
• 3 結(jié)果與分析64-77
• 3.1 白木香總RNA的提取64
• 3.2 白木香JA信號通路中關(guān)鍵基因的克隆與生物信息學分析64-77
• 3.2.1 白木香AsLOX1基因64-67
• 3.2.2 白木香AsCOI1基因67-70
• 3.2.3 白木香AsNINJA1基因70-72
• 3.2.4 白木香AsJAZ1基因72-74
• 3.2.5 白木香AsMYC2基因74-77
• 4 討論77-78
• 5 本章小結(jié)78
• 參考文獻78-81
• 第三章 白木香AsJAZ1基因通過茉莉酸途徑負調(diào)控擬南芥倍半萜合酶基因的表達81-99
• 1 實驗材料81-83
• 1.1 試劑81
• 1.2 儀器81-82
• 1.3 材料82
• 1.3.1 植物材料82
• 1.3.2 菌株與載體82
• 1.4 實驗所用引物的設(shè)計與合成82-83
• 2 實驗方法83-91
• 2.1 實驗材料處理83
• 2.2 總RNA的提取83
• 2.3 mRNA的分離與純化83
• 2.4 cDNA第一鏈的合成83
• 2.5 實時熒光定量PCR83
• 2.6 白木香AsJAZ1基因瞬時表達分析83-86
• 2.6.1 瞬時表達載體的構(gòu)建83-85
• 2.6.2 基因槍法轉(zhuǎn)化祥蔥表皮細胞85-86
• 2.7 白木香AsJAZ1基因轉(zhuǎn)化擬南芥86-91
• 2.7.1 過表達載體的構(gòu)建86-88
• 2.7.2 浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥88-89
• 2.7.3 轉(zhuǎn)基因植株的篩選和鑒定89-91
• 2.7.4 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中倍半萜合酶基因的表達91
• 3 結(jié)果與分析91-96
• 3.1 白木香AsJAZ1基因的表達分析91-93
• 3.1.1 傷害脅迫下AsJAZ1基因的表達模式91-92
• 3.1.2 AsJAZ1基因組織表達92-93
• 3.2 白木香AsJAZ1基因表達的亞細胞定位93
• 3.3 白木香AsJAZ1基因的過表達對擬南芥倍半萜合酶基因表達的影響93-96
• 3.3.1 植物過表達載體的構(gòu)建與鑒定93-94
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的獲得94-95
• 3.3.3 白木香AsJAZ1基因負調(diào)控擬南芥倍半萜合酶基因的表達95-96
• 4 討論96-97
• 5 本章小結(jié)97
• 參考文化97-99
• 第四章 白木香AsMYC2基因通過茉莉酸途徑正調(diào)控擬南芥倍半萜合酶基因表達99-111
• 1 實驗材料99-100
• 1.1 主要試劑99
• 1.2 儀器99
• 1.3 材料99
• 1.3.1 植物材料99
• 1.3.2 菌株與載體99
• 1.4 實驗所用引物的設(shè)計與合成99-100
• 2 實驗方法100-102
• 2.1 實驗材料處理100
• 2.2 總RNA的提取100
• 2.3 mRNA的分離與純化100
• 2.4 cDNA第一鏈的合成100
• 2.5 實時熒光定量PCR100
• 2.6 白木香AsMYC2基因瞬時表達分析100-101
• 2.6.1 瞬時表達載體的構(gòu)建100-101
• 2.6.2 基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞101
• 2.7 白木香AsMYC2基因轉(zhuǎn)化擬南芥101-102
• 2.7.1 過表達載體的構(gòu)建101-102
• 2.7.2 浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥102
• 2.7.3 轉(zhuǎn)基因植株的篩選和鑒定102
• 2.7.4 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中倍半萜合酶基因的表達102
• 3 結(jié)果與分析102-107
• 3.1 白木香AsMYC2基因的表達分析102-104
• 3.1.1 傷害脅迫下AsMYC2基因的表達模式102-103
• 3.1.2 AsMYC2基因組織表達103-104
• 3.2 白木香AsMYC2基因表達的亞細胞定位104
• 3.3 白木香AsMYC2基因過表達對擬南芥倍半萜合酶基因表達的影響104-107
• 3.3.1 植物表達載體的構(gòu)建與鑒定104-105
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的獲得105-106
• 3.3.3 白木香AsMYC2基因正調(diào)控擬南芥倍半萜合酶基因的表達106-107
• 4 討論107-108
• 5 本章小結(jié)108-109
• 參考文獻109-111
• 第五章 白木香AsJAZ1與AsMYC2蛋白相互作用研究111-127
• 1 材料與方法111-116
• 1.1 材料111-112
• 1.1.1 工具酶及主要試劑111-112
• 1.1.2 菌種及載體112
• 1.1.3 主要儀器112
• 1.1.4 實驗所用引物的設(shè)計與合成112
• 1.2 實驗方法112-116
• 1.2.1 白木香總RNA提取及cDNA的合成112
• 1.2.2 基因擴增112-113
• 1.2.3 原核表達載體的構(gòu)建113
• 1.2.4 重組蛋白的原核表達113-114
• 1.2.5 表達條件的優(yōu)化114
• 1.2.6 重組蛋白表達形式的鑒定114
• 1.2.7 重組蛋白的純化114-115
• 1.2.8 Western blotting鑒定表達蛋白115
• 1.2.9 Pull-down鑒定白木香AsJAZ1與AsMYC2蛋白體外相互作用115-116
• 2 結(jié)果與分析116-123
• 2.1 原核表達載體的構(gòu)建及鑒定116-118
• 2.1.1 AsMYC2基因原核表達載體的構(gòu)建及鑒定116-117
• 2.1.2 AsJAZ1基因原核表達載體的構(gòu)建及鑒定117-118
• 2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達118-120
• 2.2.1 GST-AsMYC2融合蛋白的誘導(dǎo)表達118-119
• 2.2.2 His-AsJAZ1融合蛋白的誘導(dǎo)表達119-120
• 2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)條件的優(yōu)化120
• 2.4 重組蛋白的表達形式120-121
• 2.4.1 GST-AsMYC2融合蛋白的表達形式120-121
• 2.4.2 His-AsJAZ1融合蛋白的表達形式121
• 2.5 重組蛋白的純化121-122
• 2.5.1 GST-AsMYC2融合蛋白的純化121-122
• 2.5.2 His-AsJAZ1融合蛋白的純化122
• 2.6 重組蛋白的鑒定122-123
• 2.7 AsJAZ1與AsMYC2蛋白體外相互作用分析123
• 3 討論123-124
• 4 本章小結(jié)124-125
• 參考文獻125-127
• 結(jié)語127-129
• 致謝129-131
• 作者簡介131

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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2 張爭;楊云;魏建和;孟慧;汪孟曦;韓曉敏;隋春;;白木香莖中內(nèi)源茉莉酸類和倍半萜類物質(zhì)對機械傷害的響應(yīng)[J];園藝學報;2013年01期

3 張爭;楊云;魏建和;孟慧;隋春;陳懷瓊;;白木香結(jié)香機制研究進展及其防御反應(yīng)誘導(dǎo)結(jié)香假說[J];中草藥;2010年01期

4 彭金英,黃勇平;植物防御反應(yīng)的兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其相互作用[J];植物生理與分子生物學學報;2005年04期

5 劉軍民,徐鴻華;國產(chǎn)沉香研究進展[J];中藥材;2005年07期

6 戚樹源,林立東,胡厚才;白木香中色酮類化合物的形成[J];中草藥;2000年09期

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8 戚樹源,林立東,葉勤法;沉香中芐基丙酮及其在黃綠墨耳真菌中的生物轉(zhuǎn)化[J];生物工程學報;1998年04期

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張興麗;傷害誘導(dǎo)的白木香防御反應(yīng)與沉香形成的關(guān)系研究[D];北京林業(yè)大學;2013年

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本文編號：720357