發(fā)布時(shí)間：2017-08-12 08:25

  本文關(guān)鍵詞：基于乳腺上皮FcRn胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的金黃色葡萄球菌多價(jià)毒力因子疫苗設(shè)計(jì)及其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答效果的研究

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【摘要】：奶牛乳房炎(Bovine Mastitis),是奶牛乳房組織受到外界刺激而引起乳房組織炎性反應(yīng)的一種疾病。引起奶牛乳房炎的病原菌種類繁多,包括細(xì)菌、真菌、病毒和支原體等,其中金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原菌之一,金黃色葡萄球菌致病的主要毒力因子包括與其表面相關(guān)的黏附素、毒素、生物被膜、莢膜多糖和酶等。金黃色葡萄球菌黏附和定植于乳腺上皮細(xì)胞,是感染的初始階段,阻斷其對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的黏附和定植,是阻止金黃色葡萄球菌感染的有效策略之一。纖連結(jié)合蛋白B(FnBPB)和凝集因子A (ClfA)是奶牛感染金黃色葡萄球菌引起乳房炎的重要黏附因子。FnBPB的D區(qū)(FnBPB-D)和ClfA的A區(qū)(ClfA-A)是與黏附相關(guān)的重要功能區(qū)。莢膜多糖也是金黃色葡萄球菌侵入機(jī)體,感染初期的重要毒力因子。新生兒Fc受體(Fc receptor, FcRn)作為識(shí)別免疫球蛋白IgG的Fc片段的特異性受體,參與跨越黏膜屏障主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)IgG,同時(shí)FcRn還能與結(jié)合了抗原的IgGFc段特異性結(jié)合,介導(dǎo)黏膜上皮細(xì)胞通過胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)IgG與抗原的復(fù)合物進(jìn)入基底層,攜帶著抗原的IgG釋放抗原；而黏膜基底層有大量的抗原遞呈細(xì)胞,T、B淋巴細(xì)胞等,從而誘導(dǎo)特異性的局部免疫,使機(jī)體黏膜表面獲得抵御病原體的能力。本研究選取Wistar大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物,在成功克隆大鼠的IgG的Fc片段后,采用SOE-PCR方法,與FnBPB-ClfA進(jìn)行串聯(lián),成功構(gòu)建了Fc-FnBPB-ClfA串聯(lián)基因,將其定向克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了以可溶性表達(dá)的重組蛋白rFc-FnBPB-ClfA。該重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),證明其分子量大小為78 KDa;經(jīng)Western Blot分析,表明該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性,且Fc、FnBPB和ClfA均具有蛋白活性。爾后,通過化學(xué)偶聯(lián)方法,以碳二亞胺(EDC)作為偶聯(lián)劑,將CP8與Fc-FnBPB-ClfA以1.89：1的質(zhì)量比進(jìn)行偶聯(lián),成功制備偶聯(lián)物CP8+Fc-FnBPB-ClfA.最后,將上述融合蛋白FnBPB-ClfA、融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA、偶聯(lián)物CP8+FnBPB-ClfA和偶聯(lián)物CP8+Fc-FnBPB-ClfA分別通過肌肉注射和乳頭管注射(乳頭管注射部位為右側(cè)腹部第4對(duì)乳頭,R4)這兩種不同的免疫途徑,配合鋁鹽佐劑和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位佐劑(LTB)兩種不同的免疫佐劑對(duì)處于哺乳期的Wistar大鼠進(jìn)行免疫。其中,融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA免疫組,通過肌肉注射進(jìn)行首次免疫(muscle, M),經(jīng)乳頭管注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫(teat canal, TC)的免疫方案,配合LTB黏膜佐劑免疫處于哺乳期的Wistar大鼠；同時(shí),用本研究制備的大鼠抗FnBPB-ClfA的血清分別與融合蛋白FnBPB-ClfA和融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA等量混合,制成抗原-抗體復(fù)合物疫苗,以LTB為佐劑,通過乳頭管注射,免疫哺乳期的Wistar大鼠。免疫后通過免疫指標(biāo)的檢測(cè)評(píng)價(jià)各免疫組的免疫效果。通過ELISA方法檢測(cè)免疫組大鼠血清和乳清中的特異性抗體效價(jià)、IgG的亞型測(cè)定、Thl/Th2類細(xì)胞因子的表達(dá)水平；將加強(qiáng)免疫7d后的各免疫組大鼠進(jìn)行T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、大鼠全血的吞噬調(diào)理試驗(yàn)及大鼠乳腺組織的免疫組化試驗(yàn)；將加強(qiáng)免疫14d后的大鼠經(jīng)右側(cè)R4乳頭管灌注金黃色葡萄球菌進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果表明,融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA通過肌肉注射進(jìn)行首次免疫,經(jīng)乳頭管注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫,配合LTB佐劑(M-TC/LTB),加強(qiáng)免疫大鼠7d后,血清和乳清的抗體效價(jià)分別可達(dá)1：102400和1：1600；血清和乳清中IgG亞型主要以IgG1為主；血清和乳清中IL-4和IFN-γ的含量均有所提高,且高于其他免疫組；T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明,該免疫組淋巴細(xì)胞刺激指數(shù),顯著高于其他免疫組(p0.05)；全血?dú)⒕芰σ诧@著高于對(duì)照組(p0.05)；乳腺組織的免疫組化反應(yīng)呈棕褐色陽性反應(yīng)。攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明,該免疫組金黃色葡萄球菌的檢出率顯著低于其他各免疫組(p0.05)。綜上所述,各免疫組中,融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA以LTB為黏膜佐劑,通過肌肉注射進(jìn)行首次免疫,經(jīng)乳頭管注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫,以這樣的免疫方案免疫大鼠后,免疫效果最佳,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng),并在乳腺部位,誘導(dǎo)產(chǎn)生了良好的局部免疫應(yīng)答。本研究為今后金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗在生產(chǎn)實(shí)踐中的運(yùn)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 大鼠IgG Fc片段 乳頭管免疫 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.611
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-14
• 1 引言14-22
• 1.1 金黃色葡萄球菌14-16
• 1.1.1 金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性14-15
• 1.1.2 金黃色葡萄球菌的毒力因子15-16
• 1.2 奶牛乳腺的免疫防御16-17
• 1.2.1 非特異性免疫應(yīng)答17
• 1.2.2 適應(yīng)性免疫應(yīng)答17
• 1.3 金黃色葡萄球菌疫苗研究進(jìn)展17-18
• 1.3.1 全菌滅活疫苗17
• 1.3.2 亞單位疫苗17-18
• 1.3.3 核酸疫苗18
• 1.3.4 抗原-抗體復(fù)合物疫苗18
• 1.4 FeRn研究進(jìn)展18-20
• 1.5 免疫佐劑的選擇20-21
• 1.6 本研究的目的及意義21-22
• 2 研究一 Fc-FnBPB-ClfA的基因串聯(lián)22-35
• 2.1 試驗(yàn)材料22-23
• 2.1.1 質(zhì)粒及菌株22
• 2.1.2 載體與試劑22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.1.4 主要溶液22-23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-30
• 2.2.1 試驗(yàn)流程圖23-24
• 2.2.2 大鼠的總RNA的提取24
• 2.2.3 反轉(zhuǎn)錄24-26
• 2.2.4 大鼠IgG的Fc基因片段的回收及純化26-27
• 2.2.5 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc的構(gòu)建27
• 2.2.6 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc的PCR鑒定27-28
• 2.2.7 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc的提取28-29
• 2.2.8 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc的序列測(cè)定29
• 2.2.9 Fc基因與FnBPB-ClfA基因的串聯(lián)29-30
• 2.2.10 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的構(gòu)建30
• 2.2.11 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的PCR鑒定30
• 2.2.12 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的提取30
• 2.2.13 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA序列測(cè)定30
• 2.3 結(jié)果30-33
• 2.3.1 大鼠總RNA完整性鑒定30-31
• 2.3.2 IgG Fc基因片段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果31
• 2.3.3 重組質(zhì)粒pMD19T-Fc序列的測(cè)定結(jié)果及分析31-32
• 2.3.4 Fc-FnBPB-ClfA串聯(lián)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果32-33
• 2.4 討論33-34
• 2.5 小結(jié)34-35
• 3 研究二 融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA的原核表達(dá)及偶聯(lián)物CP8+Fc-FnBPB-ClfA的制備35-56
• 3.1 試驗(yàn)材料35-37
• 3.1.1 表達(dá)載體35
• 3.1.2 試劑35-36
• 3.1.3 主要儀器36
• 3.1.4 主要溶液的配制36-37
• 3.2 試驗(yàn)方法37-45
• 3.2.1 試驗(yàn)流程圖37-38
• 3.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的構(gòu)建38-40
• 3.2.3 重組蛋白Fc-FnBPB-ClfA的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物分析40-45
• 3.2.4 CP8+Fc-FnBPB-ClfA偶聯(lián)物的制備45
• 3.3 結(jié)果45-54
• 3.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的雙酶切鑒定45-46
• 3.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA序列的測(cè)定結(jié)果及分析46-49
• 3.3.3 IPTG誘導(dǎo)劑最佳濃度的確定49-50
• 3.3.4 重組蛋白的可溶性鑒定50-51
• 3.3.5 重組目的蛋白的純化51-52
• 3.3.6 Western blot分析結(jié)果52-53
• 3.3.7 CP8+Fc-FnBPB-ClfA偶聯(lián)物定性分析結(jié)果53-54
• 3.4 討論54-55
• 3.4.1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇54
• 3.4.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的構(gòu)建54-55
• 3.4.3 莢膜多糖與蛋白的偶聯(lián)55
• 3.5 小結(jié)55-56
• 4 研究三 融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA、偶聯(lián)物CP8+Fc-FnBPB-ClfA及抗原-抗體復(fù)合物疫苗的免疫效果比較56-95
• 4.1 試驗(yàn)材料56
• 4.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物56
• 4.1.2 重組蛋白與試劑56
• 4.1.3 主要儀器56
• 4.2 試驗(yàn)方法56-67
• 4.2.1 試驗(yàn)流程圖56-57
• 4.2.2 融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA濃度及偶聯(lián)物中CP8含量測(cè)定57-58
• 4.2.3 免疫動(dòng)物、免疫程序及分組情況58-60
• 4.2.4 免疫血清和乳清特異性抗體動(dòng)態(tài)檢測(cè)60-61
• 4.2.5 偶聯(lián)物免疫組中莢膜多糖和蛋白的特異性抗體檢測(cè)61
• 4.2.6 免疫血清和乳清中IgG型(IgG1/IgG2a)的測(cè)定61
• 4.2.7 T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)61-62
• 4.2.8 免疫大鼠全血的吞噬調(diào)理試驗(yàn)62
• 4.2.9 Th1/Th2類細(xì)胞因子水平的檢測(cè)62
• 4.2.10 大鼠乳腺組織免疫組化試驗(yàn)62-63
• 4.2.11 大鼠乳腺攻毒保護(hù)試驗(yàn)63-64
• 4.2.12 大鼠乳腺組織病理組織切片64-67
• 4.3 結(jié)果67-89
• 4.3.1 重組蛋白濃度測(cè)定結(jié)果67
• 4.3.2 偶聯(lián)物CP8+Fc-FnBPPB-ClfA中CP8含量的測(cè)定67-68
• 4.3.3 免疫血清IgG抗體水平動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果68
• 4.3.4 血清和乳清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果68-72
• 4.3.5 偶聯(lián)物血清特異性抗體檢測(cè)結(jié)果72-74
• 4.3.6 免疫大鼠血清和乳清中IgG1/IgG2a測(cè)定結(jié)果74-77
• 4.3.7 T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果77-78
• 4.3.8 吞噬調(diào)理試驗(yàn)結(jié)果78-79
• 4.3.9 Th1/Th2類細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果79-80
• 4.3.10 大鼠乳腺組織免疫組化試驗(yàn)80-83
• 4.3.11 大鼠的乳頭管攻毒保護(hù)試驗(yàn)83-87
• 4.3.12 大鼠乳腺組織病理切片結(jié)果87-89
• 4.4 討論89-93
• 4.4.1 金黃色葡萄球菌毒力因子的篩選與Fc的作用89-90
• 4.4.2 乳房炎模型的選擇90
• 4.4.3 抗體效價(jià)的分析90-91
• 4.4.4 淋巴細(xì)胞增殖91
• 4.4.5 吞噬調(diào)理試驗(yàn)91-92
• 4.4.6 細(xì)胞因子測(cè)定和IgG亞型的測(cè)定92
• 4.4.7 最佳免疫佐劑的選擇92-93
• 4.5 結(jié)論93-95
• 5 整體討論95-96
• 6 整體結(jié)論96-97
• 致謝97-98
• 參考文獻(xiàn)98-107
• 作者簡(jiǎn)介107

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：660658