本文關(guān)鍵詞：錦橙晚熟性狀機(jī)理探討及候選基因的鑒定

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【摘要】：果實(shí)的成熟是一個(gè)集糖酸代謝、細(xì)胞壁代謝、色素代謝、能量代謝等多種生物學(xué)途徑的復(fù)雜過程。目前,對(duì)于果實(shí)成熟的機(jī)理研究還不夠完善,特別是對(duì)于柑橘這種非躍變型水果的成熟機(jī)理研究較少。因此研究柑橘的成熟機(jī)理,從而有的放矢地選育柑橘早晚熟品種,以及從栽培上調(diào)整現(xiàn)有品種的成熟期,對(duì)于柑橘產(chǎn)業(yè)意義重大。錦橙晚熟芽變的發(fā)現(xiàn),為我們研究柑橘成熟調(diào)控提供了有利材料。本文通過比較研究錦橙及其熟期芽變材料的果實(shí)在不同發(fā)育成熟時(shí)期中從生理生化到分子信號(hào)層面的差異,對(duì)于錦橙發(fā)育成熟過程中的變化有了較全面的了解,并且鑒定出多個(gè)柑橘發(fā)育成熟相關(guān)代謝途徑及關(guān)鍵基因。主要研究結(jié)果如下:1.果實(shí)糖酸品質(zhì)方面:錦橙果實(shí)發(fā)育成熟過程中,總的可溶性固形物含量、蔗糖含量、果糖含量、葡萄糖含量、維生素C含量、單果重及果皮色澤指數(shù)都呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)至完熟后下降;而總的可滴定酸、檸檬酸和奎寧酸的含量則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),并且在果實(shí)成熟中期,晚熟錦橙果實(shí)中的檸檬酸含量明顯較普通錦橙果實(shí)中的高;特殊的是蘋果酸含量的變化趨勢(shì)表現(xiàn)為果實(shí)開始轉(zhuǎn)色后逐漸上升至快完熟時(shí)逐漸下降。2.內(nèi)源激素方面:錦橙果實(shí)發(fā)育過程中,脫落酸在果實(shí)中的含量最高,其變化趨勢(shì)為“M”字型,在果實(shí)剛開始轉(zhuǎn)色和快完熟時(shí)含量最高;茉莉酸含量較低,總體呈逐漸下降的趨勢(shì),不過在發(fā)育成熟前期晚熟錦橙果實(shí)中的茉莉酸含量明顯高于普通錦橙果實(shí);生長(zhǎng)素含量最低,并且呈現(xiàn)先逐漸下降待果實(shí)完全成熟時(shí)稍微上升的趨勢(shì)。3.基因表達(dá)方面:重點(diǎn)分析了蔗糖、脫落酸、茉莉酸代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因在錦橙果實(shí)不同發(fā)育成熟期的表達(dá)量變化趨勢(shì)。蔗糖合成關(guān)鍵基因?yàn)镃s SPS和Cs SUS,二者分別在果實(shí)成熟前期和后期發(fā)揮作用,前者主要與果實(shí)轉(zhuǎn)色后蔗糖含量的上升相關(guān),后者主要與果實(shí)中的葡萄糖含量及果糖含量的變化趨勢(shì)相關(guān);大多數(shù)脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)整體表現(xiàn)為隨著果實(shí)成熟不斷上升,揭示了脫落酸在甜橙果實(shí)成熟過程中發(fā)揮正調(diào)控作用;果肉中茉莉酸合成相關(guān)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)與內(nèi)源茉莉酸含量變化趨勢(shì)不一致,說明在錦橙果實(shí)成熟過程中茉莉酸的合成還會(huì)受到其它因素的影響,而果實(shí)成熟后期茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因的表達(dá)量逐漸上升,說明茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了果實(shí)的成熟調(diào)控過程。此外,這三個(gè)通路中有很多基因有著相近的表達(dá)模式。4.轉(zhuǎn)錄組分析方面:重點(diǎn)分析了普通錦橙及其晚熟芽變果實(shí)在轉(zhuǎn)色初始時(shí)果肉中的整體轉(zhuǎn)錄組差異,共找到13,412個(gè)差異Unigene,主要集中于代謝途徑、植物-病原菌相互作用、剪接體、植物激素合成和類苯基丙烷合成5個(gè)途徑。差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子主要集中于Myb、AP2/ERF、MADS-box和WRKY四大家族。此外,隨著果實(shí)不斷成熟,它的整體轉(zhuǎn)錄水平反而下降。5.錦橙轉(zhuǎn)錄組的SSR分布:在所檢測(cè)的所有unigene中約11%的序列含有SSR位點(diǎn),其中主要重復(fù)類型依次為單核苷酸、三核苷酸和二核苷酸重復(fù)類型;主要重復(fù)基序依次為A/T、AG/CT和AAG/CTT。6.SSR分子標(biāo)記的開發(fā):根據(jù)含有SSR位點(diǎn)的正向差異基因序列設(shè)計(jì)特意引物52對(duì),其中33對(duì)能在臍橙、i*柑和寬皮橘中獲得清晰的目的條帶,說明本次開發(fā)的SSR引物在柑橘相近種間具有可轉(zhuǎn)移性;18對(duì)在16個(gè)熟期差異柑橘品種中獲得多態(tài)性條帶;多態(tài)性信息指數(shù)最高的unigene為TCP家族成員,其在柑橘果實(shí)不同發(fā)育成熟期差異表達(dá),并且其啟動(dòng)子區(qū)存在多種植物激素調(diào)控元件。綜上所述,錦橙的晚熟芽變致使果實(shí)發(fā)育過程中多個(gè)代謝途徑相關(guān)基因以及產(chǎn)物含量都發(fā)生了變化,不僅證明果實(shí)成熟是個(gè)復(fù)雜綜合的過程,也說明該芽變處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游或者交叉點(diǎn)上,雖然找到這個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)很難,但是在尋找的過程中發(fā)現(xiàn)許多與果實(shí)成熟調(diào)控相關(guān)的途徑和基因,為研究果實(shí)成熟提供了新的依據(jù)和基礎(chǔ)。同時(shí)新開發(fā)的分子標(biāo)記為柑橘遺傳圖譜構(gòu)建、不同品種親緣關(guān)系分析及分子標(biāo)記輔助育種提供了新的工具。
【關(guān)鍵詞】：柑橘 果實(shí)成熟 RNA-seq 植物激素 TCP
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S666.4
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 第一章 前言13-23
• 1 課題的提出13-14
• 2 前人研究進(jìn)展14-22
• 2.1 芽變與果實(shí)成熟14-15
• 2.2 果實(shí)成熟機(jī)理研究進(jìn)展15-20
• 2.2.1 果實(shí)成熟相關(guān)組學(xué)方面研究進(jìn)展15-16
• 2.2.2 果實(shí)成熟相關(guān)果實(shí)品質(zhì)研究進(jìn)展16-17
• 2.2.3 果實(shí)成熟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及小RNA研究進(jìn)展17-19
• 2.2.4 果實(shí)成熟相關(guān)植物激素研究進(jìn)展19-20
• 2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與SSR分子標(biāo)記開發(fā)20-22
• 2.3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究進(jìn)展20-21
• 2.3.2 基于新一代測(cè)序技術(shù)的SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用21-22
• 3 本研究的目的和內(nèi)容22-23
• 第二章 錦橙及其晚熟芽變果實(shí)成熟過程中內(nèi)外品質(zhì)比較分析23-55
• 1 引言23
• 2 材料與方法23-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 2.1.1 植物材料23-24
• 2.1.2 主要生化試劑及實(shí)驗(yàn)儀器24-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-39
• 2.2.1 砧木遺傳背景鑒定26-31
• 2.2.2 果實(shí)外觀品質(zhì)測(cè)定31
• 2.2.3 果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)測(cè)定31-35
• 2.2.4 果實(shí)成熟相關(guān)基因表達(dá)譜測(cè)定35-39
• 3 結(jié)果與分析39-50
• 3.1 普通錦橙及其晚熟芽變砧木遺傳背景分析39-40
• 3.2 錦橙及其晚熟芽變果實(shí)外觀品質(zhì)分析40-41
• 3.2.1 果實(shí)色澤參數(shù)測(cè)定40-41
• 3.2.2 單果重及果形指數(shù)測(cè)定41
• 3.3 錦橙及其晚熟芽變果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)分析41-45
• 3.3.1 果實(shí)常規(guī)品質(zhì)分析41-43
• 3.3.2 果實(shí)可溶性糖酸含量分析43-45
• 3.3.3 果肉中內(nèi)源ABA，JA及IAA含量分析45
• 3.4 果實(shí)成熟相關(guān)基因表達(dá)譜分析45-50
• 3.4.1 果實(shí)成熟過程中蔗糖合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)譜分析.3345-46
• 3.4.2 果實(shí)成熟過程中ABA合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)譜分析46-47
• 3.4.3 果實(shí)成熟過程中JA合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)譜分析47-50
• 4 討論50-55
• 4.1 錦橙果實(shí)發(fā)育成熟過程中的果實(shí)品質(zhì)變化50
• 4.2 錦橙果實(shí)發(fā)育成熟過程中內(nèi)源激素變化50-52
• 4.3 錦橙果實(shí)成熟過程中蔗糖，ABA和JA可能的互作模式52-55
• 第三章 錦橙及其晚熟芽變果實(shí)成熟早期轉(zhuǎn)錄組分析及SSR分子標(biāo)記的開發(fā)55-98
• 1 引言55-56
• 2 材料與方法56-62
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料56
• 2.2 試驗(yàn)方法56-62
• 2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序56-58
• 2.2.2 錦橙轉(zhuǎn)錄組SSR分布58
• 2.2.3 SSR分子標(biāo)記的開發(fā)58-61
• 2.2.4 qRT-PCR分析基因表達(dá)61
• 2.2.5 基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析61-62
• 3 結(jié)果與分析62-91
• 3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序62-74
• 3.1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)62-63
• 3.1.2 Unigene注釋63-66
• 3.1.3 差異表達(dá)基因分析66-74
• 3.1.4 qRT-PCR驗(yàn)證74
• 3.2 錦橙SSR分布74-77
• 3.2.1 SSR位點(diǎn)搜索74-75
• 3.2.2 SSR重復(fù)基序長(zhǎng)度及類型分布75-77
• 3.3 SSR分子標(biāo)記的開發(fā)77-82
• 3.3.1 SSR引物的設(shè)計(jì)77-78
• 3.3.2 SSR引物的篩選78-79
• 3.3.3 SSR引物多態(tài)性評(píng)價(jià)及其應(yīng)用79-82
• 3.4 熟期候選基因CsTCP2 分析82-91
• 3.4.1 CsTC2P基因在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)譜分析82-83
• 3.4.2 CsTCP2 基因及ABA，，JA合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析83-91
• 4 討論91-98
• 4.1 錦橙果實(shí)成熟早期轉(zhuǎn)錄組水平91-92
• 4.2 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的柑橘SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用92-95
• 4.3 柑橘TCP2 功能探討95-97
• 4.4 后續(xù)研究設(shè)想及展望97-98
• 參考文獻(xiàn)98-118
• 圖版118-121
• 附錄Ⅰ 相關(guān)數(shù)據(jù)列表121-136
• 附錄II攻讀博士期間發(fā)表的論文136-137
• 致謝137-138

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：654259