本文關(guān)鍵詞：小麥泛素系統(tǒng)關(guān)鍵組分基因TaUb2和TaPUB1的功能分析

  更多相關(guān)文章： 小麥(Triticum aestivum L.) 泛素/26S蛋白酶體途徑 泛素 U-box蛋白 E3泛素連接酶 生物脅迫 鹽脅迫

【摘要】：小麥(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的糧食作物之一。小麥在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常受到各種逆境脅迫。泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是植物中最重要的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)機(jī)制之一。該系統(tǒng)主要由泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)、26S蛋白酶體和泛素組成。研究發(fā)現(xiàn)UPS參與許多生物過(guò)程,包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期和逆境脅迫響應(yīng)等。泛素是一個(gè)含有76個(gè)氨基酸的球狀蛋白,存在于幾乎所有的真核生物中,且高度保守。它主要以兩種類(lèi)型存在:單體泛素和多聚化泛素。在植物細(xì)胞中,游離態(tài)的泛素和結(jié)合態(tài)的泛素處于動(dòng)態(tài)平衡中。盡管細(xì)胞內(nèi)泛素水平相對(duì)較高,但是自由的未結(jié)合的泛素非常的少。在脅迫條件下,植物細(xì)胞會(huì)積累大量的異常和受損的蛋白質(zhì)。及時(shí)清除這些非正常蛋白具有重要意義,而這個(gè)過(guò)程受自由態(tài)泛素水平的影響。E3連接酶是UPS系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,它決定了被泛素化蛋白的特異性。根據(jù)亞基構(gòu)成和作用機(jī)制,植物中的E3主要有:HECT結(jié)構(gòu)域家族、RING結(jié)構(gòu)域家族和U-box結(jié)構(gòu)域家族等。U-box結(jié)構(gòu)域最先在酵母中發(fā)現(xiàn)的,是一個(gè)大約含有75個(gè)氨基酸的高度保守的結(jié)構(gòu)域。已鑒定的許多含U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白隨后都發(fā)現(xiàn)具有E3連接酶的活性。本實(shí)驗(yàn)室之前克隆了小麥泛素基因TaUb2,并獲得了過(guò)表達(dá)煙草(Nicotiana tabacum L.)株系。本文我們利用過(guò)表達(dá)TaUb2煙草研究了該基因在植物生物脅迫耐性中的功能。同時(shí),我們還從小麥中分離到一個(gè)新的U-box基因TaPUB1。對(duì)該基因進(jìn)行序列比對(duì)并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析。構(gòu)建真核表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化本生煙,從而獲得了TaPUB1過(guò)表達(dá)的本生煙植株。利用轉(zhuǎn)基因植株對(duì)基因在逆境適應(yīng)中的功能進(jìn)行了深入研究。主要結(jié)論如下:1.TaUb2在植物生物脅迫耐性中的功能(1)丁香假單胞桿菌Pst DC3000屬于革蘭氏陰性細(xì)菌,被廣泛地用于研究植物的生物脅迫響應(yīng)。Pst DC3000處理后,與野生型煙草相比,TaUb2過(guò)表達(dá)煙草葉片中的細(xì)菌生物量減少且葉片壞死、萎黃現(xiàn)象較輕。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Pst DC3000處理小麥能顯著上調(diào)內(nèi)源TaUb2的表達(dá)。這些結(jié)果表明TaUb2過(guò)表達(dá)煙草能夠提高對(duì)Pst DC3000的抗性。(2)經(jīng)Pst DC3000處理后,轉(zhuǎn)基因植物的氣孔孔徑變小,僅為野生型煙草的1/2-2/3。同時(shí),我們又對(duì)感染Pst DC3000的各個(gè)株系葉片進(jìn)行失水速率檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型相比,過(guò)表達(dá)煙草的失水速率較慢,這與經(jīng)Pst DC3000處理后過(guò)表達(dá)煙草葉片的氣孔孔徑較小一致。pstdc3000處理后,與野生型相比,過(guò)表達(dá)煙草的電解質(zhì)外滲量和丙二醛含量較低,apx、pod和sod的酶活升高。這些結(jié)果表明,氣孔開(kāi)度的減小和抗氧化能力的提高可能參與轉(zhuǎn)基因植株的抗病性。(3)注射pstdc3000后,轉(zhuǎn)基因煙草中觀察到更多的活性氧和超敏反應(yīng)。同時(shí),pstdc3000處理后,發(fā)現(xiàn)參與sar信號(hào)途徑的幾個(gè)pr基因在轉(zhuǎn)基因煙草中上調(diào)幅度明顯高于野生型煙草。這些結(jié)果表明ros誘導(dǎo)的、hr激活的sar可能參與轉(zhuǎn)基因植株的抗病性。2.小麥u-box基因tapub1的克隆與功能研究(1)通過(guò)同源克隆策略從小麥中分離到一個(gè)u-box基因tapub1(jx307854)。該基因cdna全長(zhǎng)為1932bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?593bp,共編碼531個(gè)氨基酸。該蛋白的分子量約為57.8kda,等電點(diǎn)為5.96。該蛋白的n端有保守的u-box結(jié)構(gòu)域和prp19超家族,c端有幾個(gè)wd40重復(fù)片段。(2)將p35s-tapub1-gfp融合蛋白在洋蔥和本生煙表皮中瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)熒光顯微鏡觀察到熒光蛋白分布在胞質(zhì)和細(xì)胞核中。(3)qrt-pcr檢測(cè)tapub1在小麥不同部位的表達(dá)以及在各種外源激素和逆境脅迫處理下的內(nèi)源tapub1的表達(dá)模式。結(jié)果表明tapub1在小麥根、莖和葉中均有表達(dá),其中葉片中的表達(dá)最豐富。nacl、peg6000、cdcl2、pstdc3000等逆境脅迫均能誘導(dǎo)tapub1上調(diào)表達(dá)。外源施加植物激素如aba、sa、meja和eth也可不同程度地誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。(4)將tapub1cdna全長(zhǎng)正向插入到植物表達(dá)載體prok2的camv35s啟動(dòng)子的下游。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化本生煙。通過(guò)抗性篩選、轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的檢測(cè),最終選取了oe9、oe10、oe113個(gè)過(guò)表達(dá)株系并用于進(jìn)一步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)tapub1提高了本生煙對(duì)鹽脅迫的耐性。鹽脅迫條件下,與野生型相比,過(guò)表達(dá)株系的種子萌發(fā)率較高,而且發(fā)芽速度快;與野生型植株相比,過(guò)表達(dá)tapub1幼苗及成苗在鹽脅迫下表現(xiàn)出較長(zhǎng)的主根,較高的葉綠素含量和較好的生長(zhǎng)表型。這些說(shuō)明過(guò)表達(dá)tapub1提高了本生煙的耐鹽性。(5)鹽脅迫下,過(guò)表達(dá)植株中積累較多的脯氨酸和可溶性糖,水勢(shì)較低,表明轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累,降低水勢(shì),進(jìn)而在一定程度上緩解由鹽脅迫造成的水分脅迫。鹽脅迫還會(huì)對(duì)植物造成離子毒害。過(guò)表達(dá)株系通過(guò)減少na+吸收,降低na+/k+比率,進(jìn)而在一定程度上維持離子平衡,減輕離子毒害。鹽脅迫存在的同時(shí)還伴隨著氧化脅迫。轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)提高抗氧化酶的活性,及時(shí)清除ROS,進(jìn)而減輕由ROS引發(fā)的氧化傷害。在鹽處理時(shí),一些滲透脅迫和抗氧化酶相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平明顯地高于野生型。(6)過(guò)表達(dá)TaPUB1還能提高本生煙對(duì)水分脅迫、重金屬鎘的耐性,同時(shí)增加了本生煙對(duì)Pst DC3000的感病性。(7)過(guò)表達(dá)TaPUB1影響本生煙的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)轉(zhuǎn)基因本生煙的表型觀察發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)TaPUB1影響了本生煙的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,包括種子大小、葉片厚度、葉片數(shù)目和株高等。
【關(guān)鍵詞】：小麥(Triticum aestivum L.) 泛素/26S蛋白酶體途徑 泛素 U-box蛋白 E3泛素連接酶 生物脅迫 鹽脅迫
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S512.1
【目錄】：

• 中文摘要12-15
• Abstract15-18
• 1 前言18-31
• 1.1 泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)18-24
• 1.1.1 泛素19-20
• 1.1.2 泛素活化酶20
• 1.1.3 泛素結(jié)合酶20
• 1.1.4 泛素連接酶20-23
• 1.1.5 26S蛋白酶體23-24
• 1.2 UPS與非生物脅迫耐性24-26
• 1.2.1 泛素（Ub）在非生物脅迫中的作用24
• 1.2.2 U-box與非生物脅迫耐性24-26
• 1.3 UPS與生物脅迫26-28
• 1.3.1 泛素與生物脅迫27
• 1.3.2 U-box與生物脅迫27-28
• 1.4 UPS與植物的生長(zhǎng)發(fā)育28-30
• 1.4.1 泛素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響28
• 1.4.2 U-box蛋白與植物激素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控28-30
• 1.5 本研究的目的意義30-31
• 2 材料與方法31-49
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-33
• 2.1.1 植物材料31
• 2.1.2 材料的培養(yǎng)和處理31
• 2.1.2.1 小麥的培養(yǎng)和處理31
• 2.1.2.2 煙草的培養(yǎng)及處理31
• 2.1.3 菌株和質(zhì)粒31
• 2.1.4 酶與各種生化試劑31
• 2.1.5 PCR引物31-33
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法33-49
• 2.2.1 利用Trizol試劑盒提取RNA33-34
• 2.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈的合成34
• 2.2.3 CTAB法提取植物基因組DNA34-35
• 2.2.4 3′RACE35-37
• 2.2.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建37
• 2.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化37-38
• 2.2.7 轉(zhuǎn)化菌落PCR鑒定38
• 2.2.8 質(zhì)粒的提取38
• 2.2.9 目的片段和質(zhì)粒DNA的酶切鑒定38-39
• 2.2.10 目的片段與質(zhì)粒DNA的連接39
• 2.2.11 根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化39-40
• 2.2.11.1 根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備39
• 2.2.11.2 凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA440439-40
• 2.2.12 TaPUB1::GFP融合蛋白亞細(xì)胞定位40-41
• 2.2.13 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化41-42
• 2.2.14 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)42-43
• 2.2.15 熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá)43
• 2.2.16 蛋白雜交分析43-46
• 2.2.17 生理指標(biāo)的測(cè)定46-47
• 2.2.18 植物對(duì)病原菌抗性分析47-48
• 2.2.19 統(tǒng)計(jì)分析48-49
• 3 結(jié)果與分析49-79
• 3.1 TaUb2過(guò)表達(dá)煙草對(duì)病原菌的抗性49-54
• 3.1.1 TaUb2過(guò)表達(dá)煙草對(duì)Pst DC3000抗性的表型觀察49-50
• 3.1.2 TaUb2過(guò)表達(dá)改變了煙草葉片氣孔對(duì)Pst DC3000的響應(yīng)50-51
• 3.1.3 Pst DC3000感染對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草抗氧化方面的影響51-52
• 3.1.4 Pst DC3000使轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)生ROS迸發(fā)并誘導(dǎo)HR反應(yīng)52-53
• 3.1.5 Pst DC3000感染誘發(fā)疾病相關(guān)基因的表達(dá)53-54
• 3.2 小麥U-box基因Ta PUB1的分離及序列特征分析54-57
• 3.2.1 小麥U-box基因TaPUB1的分離54-55
• 3.2.2 TaPUB1全長(zhǎng)cDNA及編碼蛋白質(zhì)序列的特征分析55-56
• 3.2.3 TaPUB1序列系統(tǒng)發(fā)生分析56-57
• 3.3 TaPUB1的亞細(xì)胞定位57-58
• 3.4 TaPUB1基因在小麥中的表達(dá)模式分析58-60
• 3.4.1 TaPUB1基因在小麥不同器官中的表達(dá)模式58
• 3.4.2 小麥中TaPUB1基因表達(dá)水平對(duì)不同逆境脅迫處理的響應(yīng)58-60
• 3.4.3 TaPUB1基因表達(dá)對(duì)激素的響應(yīng)模式60
• 3.5 TaPUB1抗體制備60-62
• 3.5.1 原核表達(dá)載體pET-TaPUB1的構(gòu)建60-61
• 3.5.2 TaPUB1蛋白表達(dá)及抗體獲得61-62
• 3.6 TaPUB1基因在本生煙中的遺傳轉(zhuǎn)化62-64
• 3.6.1 35S::TaPUB1真核表達(dá)載體的構(gòu)建62-63
• 3.6.2 轉(zhuǎn)TaPUB1本生煙陽(yáng)性植株的篩選63-64
• 3.7 過(guò)表達(dá)TaPUB1本生煙的耐鹽性分析64-73
• 3.7.1 過(guò)表達(dá)TaPUB1對(duì)鹽脅迫下本生煙種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響64-65
• 3.7.2 過(guò)表達(dá)TaPUB1對(duì)鹽脅迫下成苗期本生煙耐鹽性的影響65-68
• 3.7.3 鹽脅迫對(duì)野生型和過(guò)表達(dá)本生煙滲透調(diào)節(jié)能力及Na+、K+的影響68-69
• 3.7.4 過(guò)量表達(dá)TaPUB1增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因本生煙的抗氧化能力69-73
• 3.8 過(guò)表達(dá)TaPUB1轉(zhuǎn)基因本生煙對(duì)其它逆境脅迫的耐性73-75
• 3.8.1 過(guò)表達(dá)TaPUB1轉(zhuǎn)基因本生煙對(duì)水分脅迫的耐性73-74
• 3.8.2 過(guò)表達(dá)TaPUB1本生煙對(duì)重金屬脅迫的耐性74-75
• 3.8.3 過(guò)表達(dá)TaPUB1本生煙對(duì)Pst DC3000感染的影響75
• 3.9 過(guò)表達(dá)TaPUB1對(duì)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響75-79
• 4 討論79-85
• 4.1 過(guò)表達(dá)TaUb2提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)病原菌的抗性79-81
• 4.2 小麥TaPUB1的克隆及其在逆境脅迫耐性中的功能分析81-85
• 5 結(jié)論85-86
• 參考文獻(xiàn)86-98
• 致謝98-99
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況99

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 喻海峰;高飛;朱小蕾;高智謀;郭敏;;稻瘟病菌Mofbox基因缺失突變體構(gòu)建及生物學(xué)表型分析[J];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年05期

2 Jalil Pirayesh Islamian;Mohsen Mohammadi;Behzad Baradaran;;Inhibition of human esophageal squamous cell carcinomas by targeted silencing of tumor enhancer genes: an overview[J];Cancer Biology & Medicine;2014年02期

3 徐夢(mèng)思;黃濤;劉麗娟;楊飛;魯慧文;翟騰蛟;陳亞楠;;豬SKP1基因的克隆及其在梅山豬與杜洛克豬卵泡中的表達(dá)研究[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2015年07期

4 Elaine Y.C.Hsia;Yirui Gui;Xiaoyan Zheng;;Regulation of Hedgehog signaling by ubiquitination[J];Frontiers in Biology;2015年03期

5 Xue Zhao;Feng Han;Shihua Shen;;Proteomics study of the effects of high pigment-1 on plastid differentiation during the ripening of tomato fruits[J];Chinese Science Bulletin;2014年13期

6 陳娟;姚瑞楓;陳泓宇;李海鷗;謝道昕;閆建斌;;F-box蛋白COI1穩(wěn)定性調(diào)控機(jī)制[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2014年10期

7 田洋;曾嚴(yán);張靜;楊承光;嚴(yán)亮;王宣軍;史崇穎;謝靜;戴天me;彭磊;曾寰宇;徐安妮;黃業(yè)偉;張佳進(jìn);馬嘯;董揚(yáng);郝淑美;盛軍;;辣木(Moringa oleifera Lam.)的高質(zhì)量參考基因組[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2015年05期

8 TIAN Yang;ZENG Yan;ZHANG Jing;YANG Cheng Guang;YAN Liang;WANG XuanJun;SHI ChongYing;XIE Jing;DAI TianYi;PENG Lei;ZENG HUAN Yu;XU An Ni;HUANG YeWei;ZHANG JiaJin;MA Xiao;DONG Yang;HAO ShuMei;SHENG Jun;;High quality reference genome of drumstick tree(Moringa oleifera Lam.), a potential perennial crop[J];Science China(Life Sciences);2015年07期

9 陳英;邵志龍;王浩然;朱燕宇;朱嵊;黃敏仁;;楊樹(shù)PeAFB基因克隆及表達(dá)模式初步分析[J];林業(yè)科學(xué);2015年08期

10 張志威;孫嬰寧;榮恩光;李輝;王寧;;雞FBXO38轉(zhuǎn)錄剪接體1的克隆、表達(dá)和功能分析[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2013年09期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 藍(lán)虹霞;兩個(gè)水稻泛素化相關(guān)鋅指蛋白及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白OZT1的功能研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 郭正光;兩種高效研究泛素連接酶底物的新策略[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

3 王改萍;楸樹(shù)花器官特性及自交不親和性研究[D];南京林業(yè)大學(xué);2013年

4 陳明輝;宿根矮化病菌誘導(dǎo)下甘蔗激素含量、超微結(jié)構(gòu)變化及差異表達(dá)基因分析[D];廣西大學(xué);2013年

5 武軍凱;‘金墜梨’自交親和性分子遺傳分析及MdSFBB9α和MdSFBB9β基因功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 王鵬;RING結(jié)構(gòu)泛素連接酶RNF186的功能研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

7 周淑梅;小麥F-box蛋白基因TaFBA1的分離與功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 郭衛(wèi)麗;辣椒對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)與其低溫抗性相關(guān)基因的克隆和功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

9 王曉清;擬南芥抗病突變體cpr30的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及抗病機(jī)制初探[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 董愫;SCF~(FBXL19)調(diào)節(jié)Rac3蛋白泛素化和降解的研究[D];吉林大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周琦淵;棉花GhTIR1基因?qū)M南芥突變體的回復(fù)及其對(duì)棉鈴發(fā)育的影響[D];西南大學(xué);2013年

2 許高歌;桃和‘早酥’梨自交（不）親和性分子機(jī)制的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 靳曉琳;缺鎂脅迫下柑橘幼苗cDNA-AFLP分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2013年

4 陳陽(yáng);CacyBP/SIP在胃癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期依賴性轉(zhuǎn)位現(xiàn)象及調(diào)控機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 王力;環(huán)指蛋白180在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

6 萬(wàn)振;CD8α~+樹(shù)突狀細(xì)胞特異性基因PCNP的克隆、鑒定及作用[D];河南大學(xué);2013年

7 李朋飛;西瓜多倍體誘導(dǎo)及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 尹翔;肌小節(jié)Z線蛋白Cypher泛素化降解的初步研究[D];浙江大學(xué);2013年

9 屈燦;TRIM25過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞H1299順鉑敏感性的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

10 韓晨霞;芍藥耐熱生理機(jī)制的初步研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：647710