本文關(guān)鍵詞：甜菜夜蛾蛹黑突變體的適合度變化及其黑化機(jī)制研究

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【摘要】：甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)(鱗翅目:夜蛾科)是一種重要的世界性分布的多食性農(nóng)業(yè)害蟲。甜菜夜蛾蛹黑突變體(Spodoptera exigua melanic mutant,SEM)是2003年自湖北省荊州市棉田中采集的正常型甜菜夜蛾(Spodoptera exigua wild-type,SEW)經(jīng)室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)至6代出現(xiàn),其表型為蛹黑色,至今12年,蛹黑色性狀穩(wěn)定,未發(fā)生任何分離變化或回復(fù)突變,成為甜菜夜蛾的一個穩(wěn)定的蛹黑突變品系(SEM)。本研究對SEM的形態(tài)進(jìn)行連續(xù)觀察,對適合度變化進(jìn)行了系統(tǒng)比較研究,研究了黑色素合成相關(guān)基因在SEM品系和SEW品系之間的差異表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,為深入認(rèn)識蛹黑突變形成機(jī)制,進(jìn)一步解釋蛹黑突變與相關(guān)生物學(xué)性狀改變之間的聯(lián)系提供理論依據(jù),為全面了解SEM品系產(chǎn)生的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。取得以下研究結(jié)果:1甜菜夜蛾蛹黑突變品系較正常品系的適合度明顯提高甜菜夜蛾SEM品系在蛹期表現(xiàn)出整體黑化,在卵期、幼蟲期、成蟲期與SEW品系無顯著差異;SEM品系化蛹后6h完成蛹表皮的黑化過程;SEM品系的世代發(fā)育速度比SEW品系顯著加快,相比SEW品系蛹重增加13.16%、交配率提高25.60%、交配次數(shù)增多66.67%、產(chǎn)卵量提高148.19%,有更高的凈生殖率(R0=275.66)和種群增長指數(shù)(I=123.73);SEW和SEM品系之間交配次數(shù)最高的是兩品系雜交組合(♀SEW×♂SEM為2.40±1.30次;♀SEM×♂SEW為2.43±1.22次),其次是SEM品系自交(1.97±1.01次),最低的是SEW自交(1.44±0.62次)。這些結(jié)果均表明SEM品系適合度較SEW有明顯提高,與已有報道的多數(shù)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的黑化昆蟲適合度較正常品系普遍降低的現(xiàn)象正好相反。綜合分析本研究結(jié)果和已有報道的14例黑化昆蟲的適合度變化研究結(jié)果,黑化昆蟲的適合度變化不依賴于黑化來源、黑化時期和黑化類型等因素。2酪氨酸羥化酶過量表達(dá)是甜菜夜蛾SEM產(chǎn)生的主要原因運(yùn)用簡并引物PCR克隆得到酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)基因、多巴脫羧酶(Dopa decarboxylase,DDC)基因和漆酶2(Laccase2)基因片段,并通過RT-PCR方法比較了SEW和SEM品系中三個基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)SEM品系中TH和DDC過表達(dá);運(yùn)用RACE技術(shù)克隆分別得到兩品系TH和DDC的c DNA序列,且運(yùn)用q RT-PCR技術(shù)研究了這兩個基因在SEW和SEM品系化蛹前后表皮組織中的表達(dá)譜;序列比對分析結(jié)果表明SEW和SEM品系的TH和DDC編碼的氨基酸序列沒有差異;在SEW和SEM化蛹前后,TH表達(dá)豐度普遍高于DDC,在預(yù)蛹期,SEM中TH和DDC相對表達(dá)量分別是SEW中的15.19倍和32.44倍,在0h蛹期,DDC在SEM品系的相對表達(dá)量是SEW中的3.08倍;通過注射ds RNA干擾SEM五齡幼蟲的TH,能在一定程度上使SEM蛹色變淺;用TH的抑制劑(3-IT)飼喂SEM品系五齡幼蟲至化蛹,蛹的黑色變淺程度隨3-IT濃度提高而增大,0.75 mg/g 3-IT可以使68.2%SEM蛹黑色出現(xiàn)變淺;當(dāng)用1 mg/g DDC的抑制劑(L-α-Methyl-DOPA)飼喂SEM品系五齡幼蟲至化蛹,只有20%SEM蛹的黑色發(fā)生較小程度的變淺。結(jié)果表明TH和DDC的過量表達(dá)與SEM品系的蛹黑表型相關(guān),且TH的作用比DDC更重要。3酪氨酸羥化酶基因啟動子結(jié)構(gòu)預(yù)示復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制通過Genome Walking技術(shù)克隆得到美國甜菜夜蛾正常型(US wild-type)、SEW品系和SEM品系的TH轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2.38kb啟動子序列;運(yùn)用JASPAR數(shù)據(jù)庫對TH基因啟動子區(qū)的順勢作用元件進(jìn)行預(yù)測,找到24個轉(zhuǎn)錄因子100%相似的作用元件,數(shù)目共計55個;在TH啟動子區(qū)內(nèi)找到7個類似核受體轉(zhuǎn)錄因子βFTZ-f1作用元件的位點(diǎn);運(yùn)用雙螢光素酶報告分析系統(tǒng),在Sf9昆蟲細(xì)胞中研究了TH基因啟動子活性,定位了TH基因啟動子基礎(chǔ)活性區(qū)域和調(diào)控區(qū)域。4βFTZ-f1基因在甜菜夜蛾SEM中過量表達(dá)綜合運(yùn)用Genome Walking技術(shù)和3’RACE技術(shù)克隆得到甜菜夜蛾US wildtype、SEW和SEM品系的βFTZ-f1的c DNA序列,并且運(yùn)用RT-PCR和q RT-PCR技術(shù)研究了βFTZ-f1在SEW和SEM品系化蛹前后表皮組織中的表達(dá)譜;序列比對分析結(jié)果表明SEW和SEM品系的βFTZ-f1編碼的氨基酸序列有一個氨基酸不同,SEM品系和US wild-type有四處氨基酸差異;預(yù)蛹晚期βFTZ-f1表達(dá)水平最高,在SEM表皮中的表達(dá)量是SEW中的7.48倍;0h蛹期,βFTZ-f1在SEM表皮中的表達(dá)量是SEW中的1.74倍;說明βFTZ-f1基因過表達(dá)可能與SEM蛹黑表型形成有關(guān)。5酪氨酸羥化酶基因受到βFTZ-f1和FTZ的正向調(diào)節(jié)運(yùn)用真核表達(dá)載體和雙螢光素酶報告分析系統(tǒng),在Sf9昆蟲細(xì)胞和人的He La細(xì)胞中過表達(dá)βFTZ-f1分別可以將TH啟動子活性提高2.66倍和1.6倍;Sf9細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)βFTZ-f1的輔激活子FTZ可以將TH啟動子活性顯著地提高1.79倍;通過EMSA試驗(yàn)在TH啟動子區(qū)定位了一個FTZ的結(jié)合位點(diǎn),未能定位到βFTZ-f1結(jié)合位點(diǎn);FTZ結(jié)合位點(diǎn)的缺失和突變不影響βFTZ-f1和FTZ對TH啟動子活性的上調(diào)作用;最后,構(gòu)建TH啟動子的截短載體結(jié)果證明在TH轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-2200~-2160區(qū)段內(nèi)可能存在βFTZ-f1的結(jié)合位點(diǎn)。綜上所述,SEM品系適合度較SEW品系顯著提高,是鮮有的實(shí)驗(yàn)室黑化昆蟲適合度提高的案例;TH基因過表達(dá)是SEM品系形成的主要原因;βFTZ-f1和FTZ能夠正向調(diào)節(jié)TH基因啟動子活性,并且TH基因啟動子區(qū)可能存在新的βFTZ-f1結(jié)合位點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：甜菜夜蛾 蛹黑突變 適合度變化 酪氨酸羥化酶 順式作用元件 βFTZ-f1轉(zhuǎn)錄因子
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433.4
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-32
• 1.1 昆蟲黑化現(xiàn)象研究概況12-21
• 1.1.1 昆蟲黑化突變的生物學(xué)意義12-15
• 1.1.2 黑色素生物合成基因在昆蟲黑化中的作用15-19
• 1.1.3 昆蟲黑色素合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式19-21
• 1.2 酪氨酸羥化酶基因的研究進(jìn)展21-26
• 1.2.1 哺乳動物和昆蟲中酪氨酸羥化酶的異同點(diǎn)21-24
• 1.2.2 酪氨酸羥化酶基因的調(diào)控機(jī)制24-26
• 1.3 FTZ-f1轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展26-29
• 1.3.1 FTZ-f1轉(zhuǎn)錄因子的功能26-28
• 1.3.2 FTZ-f1對靶基因的調(diào)控方式28-29
• 1.4 甜菜夜蛾蛹黑突變的研究現(xiàn)狀29-31
• 1.5 本研究的意義和主要內(nèi)容31-32
• 1.5.1 研究意義31
• 1.5.2 研究內(nèi)容31-32
• 第二章 甜菜夜蛾蛹黑突變體形態(tài)觀察及適合度變化研究32-45
• 2.1 材料與方法32-35
• 2.1.1 供試?yán)ハx32-33
• 2.1.2 甜菜夜蛾人工飼料的配制及飼養(yǎng)條件33
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備33
• 2.1.4 甜菜夜蛾化蛹圖像采集33
• 2.1.5 甜菜夜蛾蛹黑突變體實(shí)驗(yàn)種群生命表建立33-34
• 2.1.6 甜菜夜蛾蛹黑突變體交配能力研究34
• 2.1.7 黑化昆蟲適合度變化相關(guān)因子分析34-35
• 2.1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法35
• 2.2 結(jié)果與分析35-43
• 2.2.1 甜菜夜蛾正常型及蛹黑型蛹色漸變圖35-36
• 2.2.2 甜菜夜蛾蛹黑突變體適合度變化36-40
• 2.2.3 黑化昆蟲適合度變化的決定性因子40-43
• 2.3 討論43-45
• 第三章 甜菜夜蛾蛹黑型突變體形成的關(guān)鍵基因的克隆及功能鑒定45-82
• 3.1 材料與方法46-62
• 3.1.1 供試蟲源46
• 3.1.2 菌株和載體46
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備及耗材46
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑46-47
• 3.1.5 常用試劑及培養(yǎng)基的配制47-48
• 3.1.6 Trizol抽提甜菜夜蛾表皮組織總RNA48
• 3.1.7 c DNA第一鏈合成48-50
• 3.1.8 引物設(shè)計50
• 3.1.9 RT-PCR50
• 3.1.10 目的片段克隆50-51
• 3.1.11 5’RACE和 3’RACE51-56
• 3.1.12 半定量RT-PCR56-57
• 3.1.13 實(shí)時熒光定量PCR57-58
• 3.1.14 序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建58-59
• 3.1.15 ds RNA合成及注射59-62
• 3.1.16 酶抑制劑飼喂62
• 3.1.17 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法62
• 3.2 結(jié)果與分析62-79
• 3.2.1 酪氨酸羥化酶基因片段克隆及表達(dá)量比較分析62-64
• 3.2.2 多巴脫羧酶基因片段克隆及表達(dá)量比較分析64-65
• 3.2.3 漆酶基因片段克隆及表達(dá)量比較分析65-66
• 3.2.4 兩品系酪氨酸羥化酶基因c DNA序列分析66-69
• 3.2.5 昆蟲酪氨酸羥化酶序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建69
• 3.2.6 酪氨酸羥化酶基因在化蛹前后的表達(dá)譜69-71
• 3.2.7 酪氨酸羥化酶基因RNAi對蛹色的影響71-73
• 3.2.8 酪氨酸羥化酶抑制劑 3-IT飼喂對蛹色的影響73-75
• 3.2.9 兩品系多巴脫羧酶基因c DNA序列分析75-77
• 3.2.10 昆蟲多巴脫羧酶序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建77
• 3.2.11 多巴脫羧酶基因在化蛹前后的表達(dá)譜77-79
• 3.2.12 多巴脫羧酶抑制劑飼喂效果79
• 3.3 討論79-82
• 第四章 酪氨酸羥化酶基因啟動子克隆及分析82-101
• 4.1 材料與方法82-92
• 4.1.1 供試蟲源82-83
• 4.1.2 菌株和載體83
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備及耗材83
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑和試劑盒83
• 4.1.5 常用試劑及培養(yǎng)基的配制83-84
• 4.1.6 甜菜夜蛾基因組DNA提取84-85
• 4.1.7 Genome Walking85-86
• 4.1.8 引物設(shè)計86
• 4.1.9 巢式PCR86-87
• 4.1.10 啟動子序列分析87
• 4.1.11 螢光素酶報告基因載體構(gòu)建87-89
• 4.1.12 酪氨酸羥化酶基因啟動子 5’progressive deletion載體構(gòu)建89-90
• 4.1.13 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟90-91
• 4.1.14 細(xì)胞裂解與螢光素酶活性測定91-92
• 4.1.15 數(shù)據(jù)處理和分析方法92
• 4.2 結(jié)果與分析92-99
• 4.2.1 酪氨酸羥化酶基因啟動子調(diào)控元件預(yù)測92-96
• 4.2.2 甜菜夜蛾酪氨酸羥化酶基因啟動子活性元件定位96-99
• 4.3 討論99-101
• 第五章 轉(zhuǎn)錄因子 βFTZ-f1和FTZ對甜菜夜蛾酪氨酸羥化酶基因的調(diào)控101-147
• 5.1 材料與方法101-121
• 5.1.1 供試蟲源101
• 5.1.2 菌株和載體101-102
• 5.1.3 主要儀器設(shè)備及耗材102
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑及試劑盒102-103
• 5.1.5 常用試劑及培養(yǎng)基的配制103-104
• 5.1.6 Trizol抽提甜菜夜蛾表皮組織總RNA104
• 5.1.7 基因組DNA去除及c DNA第一鏈合成104-106
• 5.1.8 引物設(shè)計106
• 5.1.9 RT-PCR106
• 5.1.10 Genome Walking106-108
• 5.1.11 3’RACE108-109
• 5.1.12 目的片段克隆109
• 5.1.13 序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建109-110
• 5.1.14 半定量RT-PCR110
• 5.1.15 實(shí)時熒光定量PCR110-111
• 5.1.16 ds RNA合成111
• 5.1.17 β-FTZ-f1和FTZ真核表達(dá)載體構(gòu)建111-112
• 5.1.18 定點(diǎn)突變和定點(diǎn)缺失載體構(gòu)建112-116
• 5.1.19 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染116-118
• 5.1.20 細(xì)胞裂解與螢光素酶活性測定118
• 5.1.21 核蛋白的抽提118-119
• 5.1.22 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)119-121
• 5.1.23 數(shù)據(jù)處理和分析方法121
• 5.2 結(jié)果與分析121-144
• 5.2.1 甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄因子 βFTZ-f1 c DNA序列分析121-124
• 5.2.2 昆蟲 βFTZ-f1序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建124-125
• 5.2.3 βFTZ-f1在化蛹前后的表達(dá)譜125-128
• 5.2.4 βFTZ-f1對酪氨酸羥化酶基因啟動子活性調(diào)節(jié)128-130
• 5.2.5 ds RNA干擾 βFTZ-f1對酪氨酸羥化酶基因啟動子活性的影響130-131
• 5.2.6 酪氨酸羥化酶基因啟動子與βFTZ-f1的EMSA分析131-132
• 5.2.7 βFTZ-f1與FTZ對酪氨酸羥化酶的共同調(diào)節(jié)132-134
• 5.2.8 酪氨酸羥化酶基因啟動子FTZ的EMSA分析134-136
• 5.2.9 酪氨酸羥化酶基因啟動子FTZ位點(diǎn)缺失與突變分析136-138
• 5.2.10 酪氨酸羥化酶基因啟動子區(qū) βFTZ-f1結(jié)合位點(diǎn)定位138-144
• 5.3 討論144-147
• 第六章 結(jié)論和展望147-149
• 6.1 主要結(jié)論147
• 6.2 展望147-148
• 6.3 論文創(chuàng)新點(diǎn)148-149
• 參考文獻(xiàn)149-161
• 附錄1 本實(shí)驗(yàn)所涉及到的引物序列161-165
• 附錄2 本實(shí)驗(yàn)使用的載體和試劑盒165-167
• 附錄3 本實(shí)驗(yàn)克隆得到的序列167-174
• 附錄4 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文174-175
• 致謝175-177

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：644062