本文關(guān)鍵詞：牙鲆（Paralichthys olivaceus）dazl基因的克隆、表達和功能初步研究

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【摘要】：近年來,關(guān)于生殖細胞的研究被全世界學(xué)者廣泛關(guān)注,除在哺乳動物中有廣泛深入的研究以外,在魚類等低等脊椎動物中也逐漸開展起來,并取得很多進展。DAZL (deleted in azoospermia-like)是DAZ家族的成員之一,同時也是一種重要的RNA結(jié)合蛋白。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),從無脊椎動物到脊椎動物,dazl特異地表達于雌性和雄性生殖細胞,可能在生殖細胞發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。不少研究也從一些硬骨魚中鑒定了dazl基因,并對其表達規(guī)律作出了詳細的探討。本研究克隆和鑒定了牙鲆(Paralichthys olivaceus) dazl基因,首次在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)了其mRNA的可變剪接形式,將這兩種牙鲆dazl mRNA稱為Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ,探究了它們在mRNA水平和蛋白水平的表達規(guī)律,并找到了牙鲆DAZL的靶mRNA,預(yù)測其功能。首先,通過基因克隆等方法,得到了牙鲆dazl基因,全長5413 bp,包括9個外顯子和9個內(nèi)含子,其中外顯子1僅有ATG三個堿基,內(nèi)含子9位于3’非翻譯區(qū),這些特征與許多dazl同源基因是相似的。一對dazl等位基因在內(nèi)含子6的序列上有差異。由于外顯子8在轉(zhuǎn)錄或修飾時被刪除,導(dǎo)致牙鲆dazl會產(chǎn)生一種較短的mRNA,與完整的轉(zhuǎn)錄本相比,缺失外顯子8對應(yīng)的51 nt。 DAZL同源多肽序列比對發(fā)現(xiàn)在RNA識別基序(RRM)中,有7個氨基酸位點可以將硬骨魚和其它物種區(qū)分開來。牙鲆DAZL兩種多肽序列與尖吻鱸DAZL序列的一致度最高,達到80.6%和80.4%。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測到GATA、CEBP和SOX等轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控牙鲆dazl的轉(zhuǎn)錄。然后,通過反轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量PCR,驗證了Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ都特異地表達于牙鲆的精巢和卵巢,以及胚胎發(fā)育的主要時期,且Podazl-Ⅱ較Podazl-Ⅰ的表達量略高,兩者在卵巢的表達水平都明顯高于精巢,在胚胎發(fā)育到原腸中期之前的表達量較高,之后的時期表達水平很低,僅在出膜前有瞬時的升高。通過組織切片原位雜交、western blot和免疫組織化學(xué)等方法,證明Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ主要定位于雌性和雄性生殖細胞,兩者對應(yīng)的蛋白產(chǎn)物也具有性腺特異的表達模式,同樣集中表達于生殖細胞。預(yù)測到牙鲆dazl基因上游可能有兩個CpG島,通過亞硫酸鹽處理和測序,并未發(fā)現(xiàn)這兩個CpG島的甲基化水平在性腺和非性腺組織有明顯差異,可能甲基化并不是調(diào)控牙鲆dazl表達的主要方式。最后,通過RNA-蛋白免疫共沉淀和高通量測序方法,研究牙鲆卵巢中DAZL兩種蛋白可能的靶mRNA。對測序結(jié)果的注釋的分析共找到3334個可能直接或間接受到牙鲆DAZL調(diào)控的mRNA,牙鲆DAZL對組成核小體核心的組蛋白mRNA富集量最高,說明它可能參與組蛋白mRNA的處理和修飾。從靶mRNA中也找到一些與生長、發(fā)育和生殖相關(guān)的因子,如oct4、gata6、vasa、dazl和dnd等,提示牙鲆DAZL能夠調(diào)控這些重要的生物過程。GO注釋和KEGG信號通路分析,均預(yù)測牙鲆DAZL可以參與RNA處理和代謝、翻譯調(diào)控、細胞周期、蛋白代謝等多種生物過程。對PODAZL-Ⅰ和PODAZL-Ⅱ的差異靶mRNA分析,并沒有發(fā)現(xiàn)牙鲆兩種DAZL具有明顯的功能差異。最后,通過qRT-PCR進一步驗證了兩組免疫沉淀樣品中都富集了Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ,說明牙鲆DAZL可能直接或間接調(diào)控其自身mRNA.本研究對牙鲆dazl兩種mRNA和蛋白的鑒定、表達規(guī)律分析和靶mRNA分析,證明了牙鲆dazl可以作為生殖細胞標記因子應(yīng)用到今后的相關(guān)研究中。牙鲆dazl兩種mRNA和蛋白形式的表達規(guī)律比較及靶mRNA比較結(jié)果說明,兩者在功能上可能不存在明顯差異,或許牙鲆dazl較短的可變剪接形式的出現(xiàn)可以更高效的進行轉(zhuǎn)錄和翻譯,與完整的剪接形式一起,共同執(zhí)行相似的生物學(xué)功能。這些結(jié)果為牙鲆及其它硬骨魚的生殖和發(fā)育研究提供重要的參考依據(jù),為種質(zhì)資源的利用和保存、育種工作的開展奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牙鲆 生殖細胞 daz1 可變剪接 表達 靶mRNA
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻綜述12-32
• 1.1 引言12
• 1.2 魚類生殖細胞發(fā)育12-17
• 1.2.1 魚類的性別決定及相關(guān)因子12-14
• 1.2.2 魚類生殖細胞發(fā)育及相關(guān)因子14-16
• 1.2.3 魚類生殖細胞特異表達基因16-17
• 1.3 RNA結(jié)合蛋白17-20
• 1.3.1 RNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特征17-19
• 1.3.2 RNA結(jié)合蛋白的功能19-20
• 1.4 DAZ家族研究進展20-27
• 1.4.1 DAZ家族的結(jié)構(gòu)特征20-21
• 1.4.2 DAZ家族成員的進化關(guān)系21
• 1.4.3 DAZ家族的相關(guān)研究21-26
• 1.4.4 DAZ家族與人類疾病26-27
• 1.5 硬骨魚dazl表達與功能研究27-28
• 1.6 本研究的主要內(nèi)容和意義28-32
• 1.6.1 本研究的主要內(nèi)容28-30
• 1.6.2 本研究的創(chuàng)新性和意義30-32
• 第二章 牙鲆dazl基因及其可變剪接mRNA的鑒定32-57
• 2.1 引言32
• 2.2 材料與方法32-34
• 2.2.1 實驗材料32
• 2.2.2 實驗方法32-34
• 2.3 結(jié)果34-53
• 2.3.1 牙鲆dazl cDNA序列34-39
• 2.3.2 牙鲆dazl DNA序列39-44
• 2.3.3 牙鲆dazl兩種可變剪接mRNA的鑒定44-51
• 2.3.4 牙鲆dazl基因上游調(diào)控序列的預(yù)測51-53
• 2.4 討論53-57
• 2.4.1 關(guān)于實驗方法53-54
• 2.4.2 關(guān)于牙鲆dazl UTR的可變剪接54-55
• 2.4.3 關(guān)于牙鲆dazl可變剪接的意義55-56
• 2.4.4 本章小結(jié)56-57
• 第三章 牙鲆DAZL的表達規(guī)律57-80
• 3.1 引言57
• 3.2 材料與方法57-63
• 3.2.1 實驗材料57
• 3.2.2 實驗方法57-63
• 3.3 結(jié)果63-77
• 3.3.1 牙鲆dazl mRNA在各組織的相對表達水平63-64
• 3.3.2 牙鲆dazl兩種mRNA在性腺的表達64
• 3.3.3 牙鲆dazl兩種mRNA在胚胎發(fā)育時期的表達64-66
• 3.3.4 牙鲆dazl兩種mRNA在性腺的定位66-69
• 3.3.5 牙鲆dazl甲基化對其表達的調(diào)控69-72
• 3.3.6 牙鲆DAZL兩種蛋白在組織的表達72-75
• 3.3.7 牙鲆DAZL兩種蛋白在性腺的定位75-77
• 3.4 討論77-80
• 3.4.1 關(guān)于實驗方法77
• 3.4.2 關(guān)于牙鲆dazl mRNA與蛋白的表達77-79
• 3.4.3 本章小結(jié)79-80
• 第四章 牙鲆DAZL兩種蛋白的靶mRNA研究80-108
• 4.1 引言80
• 4.2 材料與方法80-85
• 4.2.1 實驗材料80
• 4.2.2 實驗方法80-85
• 4.3 結(jié)果85-104
• 4.3.1 免疫沉淀產(chǎn)物的RT-PCR檢測85-88
• 4.3.2 高通量測序結(jié)果88-89
• 4.3.3 牙鲆DAZL兩種蛋白的靶mRNA89-102
• 4.3.4 牙鲆dazl的兩種mRNA可能是其蛋白產(chǎn)物的靶mRNA102-104
• 4.4 討論104-106
• 4.4.1 關(guān)于實驗方法104-105
• 4.4.2 關(guān)于PODAZL的功能105
• 4.4.3 本章小結(jié)105-106
• 4.5 總結(jié)與展望106-108
• 參考文獻108-123
• 致謝123-124
• 個人簡歷124
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文124

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