本文關(guān)鍵詞：大白菜BrANT基因克隆及功能分析

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【摘要】：大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中國(guó),是我國(guó)的特產(chǎn)蔬菜。長(zhǎng)期以來,大白菜一直是我國(guó)和東亞國(guó)家栽培面積最大的蔬菜作物之一。經(jīng)過漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化和長(zhǎng)期的人工栽培、選育,大白菜逐步形成了以儲(chǔ)藏營(yíng)養(yǎng)為功能的葉球,葉球是食用的最主要器官。葉球的大小是一個(gè)重要的產(chǎn)量性狀,也是一個(gè)重要的商品性狀。隨著生活水平的不斷提高,人們對(duì)大白菜葉球的大小提出了多種需求。大白菜葉球大小發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制及其在育種實(shí)踐中的有效利用是一個(gè)重要的科學(xué)問題。但是,到目前為止,人們對(duì)大白菜葉球大小發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制知之甚少。通過對(duì)模式植物擬南芥的研究,人們發(fā)現(xiàn)隸屬于AP2亞家族轉(zhuǎn)錄因子的ANT(AINTEGUMENTA)是控制葉子等器官大小發(fā)育的重要因素之一。本研究利用大白菜基因組數(shù)據(jù),在全基因組水平上分析了大白菜AP2亞家族的成員組成、結(jié)構(gòu)域構(gòu)成、對(duì)應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式,并以Br ANT2基因?yàn)榇硌芯苛薃P2亞家族基因在控制葉球等器官大小方面的生物學(xué)功能。由于大白菜ANT基因?qū)θ~球大小發(fā)育的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,涉及到多個(gè)基因的協(xié)同作用,因此我們又利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)研究了Br ANT2基因過量表達(dá)后其它基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異情況。主要結(jié)果如下:1.大白菜AP2蛋白亞家族的生物信息學(xué)分析依照大白菜基因數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)(Chiifu)發(fā)現(xiàn)大白菜基因組中共存在24個(gè)AP2亞家族成員,它們不均勻地分布在10條染色體上,編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)度為549-1740bp。24個(gè)AP2亞家族成員包含的內(nèi)含子數(shù)目也呈不均勻分布,但多數(shù)成員含有6個(gè)內(nèi)含子。通過對(duì)24個(gè)成員的蛋白質(zhì)序列特征進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)所有成員均具有兩個(gè)相對(duì)保守的AP2結(jié)構(gòu)域(R1,R2)。根據(jù)R1,R2氨基酸組成的數(shù)目,我們將AP2亞家族分為7個(gè)類型,其中?73,65‘型、?70,65‘型、?63,64‘型為三個(gè)主要類型。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果,我們將大白菜AP2亞家族成員分成Ⅰ-Ⅷ8個(gè)分枝,其中大白菜Br ANT成員聚類于Ⅵ號(hào)分枝上;在進(jìn)化上,大白菜和擬南芥之間具有比水稻更近的親緣關(guān)系。2.大白菜Br ANT蛋白家族的表達(dá)模式分析采用RT-PCR方法分析了大白菜Br ANT基因在大白菜根、短縮莖、老葉、幼葉、花和花蕾六部分組織中的表達(dá)模式,結(jié)果表明:Br ANT家族成員在不同組織中的表達(dá)存在較大差異。通過對(duì)大白菜Br ANT基因在NAA處理后不同時(shí)間點(diǎn)成熟葉中的表達(dá)模式分析,我們發(fā)現(xiàn)大白菜Br ANT基因在NAA早期響應(yīng)中上調(diào)表達(dá),后逐漸趨于正常。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),不同家族成員之間的表達(dá)模式存在一定的差異,但具有相同結(jié)構(gòu)域組成的成員具有類似的表達(dá)模式。上述結(jié)果表明:不同家族成員在大白菜葉球等器官發(fā)育調(diào)控中可能發(fā)揮不同的作用。3.大白菜Br ANT2的克隆和功能分析為更好研究Br ANT基因家族的生物學(xué)功能,我們選擇了大白菜Br ANT2基因?yàn)榇磉M(jìn)行分析。大白菜Br ANT2基因位于第3號(hào)染色體上,基因全長(zhǎng)為2250bp,編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)度為1671 bp,編碼556個(gè)氨基酸殘基。利用RT-q PCR分析大白菜Br ANT2基因在葉球大小不同的品種之間結(jié)球期的表達(dá)模式,我們發(fā)現(xiàn)Br ANT2基因表達(dá)量與葉球大小呈正相關(guān)。在擬南芥中過量表達(dá)Br ANT2基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株葉子等器官的大小,同時(shí)種子的千粒重也增加。因此,我們可以將Br ANT2基因應(yīng)用于大白菜、油菜等十字花科蔬菜作物遺傳改良中,利用分子育種手段提高這些蔬菜作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量,增加其經(jīng)濟(jì)效益。4.野生型及其轉(zhuǎn)基因(35S:Br ANT2)擬南芥轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)播種后30天的轉(zhuǎn)基因(35S:Br ANT2)擬南芥及其野生型葉中的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,在野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因(35S:Br ANT2)擬南芥中共有119個(gè)基因存在顯著表達(dá)差異,其中40個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因(35S:Br ANT2)擬南芥中顯著上調(diào),79個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因(35S:Br ANT2)擬南芥中顯著下調(diào)。通過對(duì)差異表達(dá)基因的深入分析,我們得出兩點(diǎn)結(jié)論:第一,大白菜Br ANT基因可能通過復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控葉子等器官大小的發(fā)育;第二,大白菜Br ANT基因可能通過上調(diào)與細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄因子、鈣調(diào)蛋白以及光形態(tài)建成相關(guān)基因和下調(diào)伸展蛋白基因、衰老相關(guān)蛋白基因來調(diào)控葉子等器官大小的發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：大白菜 BrANT基因 器官大小 轉(zhuǎn)基因株系 表達(dá)模式
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S634.1
【目錄】：

• 摘要2-4
• Summary4-11
• 前言11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-20
• 1.1 植物中AP2/EREB基因家族研究進(jìn)展12-17
• 1.1.1 AP2/EREB基因家族結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與分類12-13
• 1.1.2 AP2/EREB基因家族起源與進(jìn)化13-14
• 1.1.3 AP2/EREB轉(zhuǎn)錄因子的作用14-17
• 1.2 ANT功能研究進(jìn)展17-19
• 1.2.1 ANT結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及分類17-18
• 1.2.2 ANT功能18-19
• 1.3 試驗(yàn)?zāi)康募耙饬x19-20
• 第二章 AP2亞家族生物信息學(xué)分析20-35
• 2.1 方法20-21
• 2.1.1 生物信息檢索20
• 2.1.2 大白菜AP2亞家族成員鑒定20
• 2.1.3 序列分析方法20
• 2.1.4 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析20
• 2.1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建方法20-21
• 2.1.6 模體（Motif）結(jié)構(gòu)分析21
• 2.1.7 基因結(jié)構(gòu)分析21
• 2.1.8 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）分析21
• 2.1.9 基因染色體分布分析21
• 2.1.10 大白菜AP2亞家族成員表達(dá)模式分析21
• 2.2 結(jié)果與分析21-33
• 2.2.1 大白菜AP2亞族成員基本信息21-23
• 2.2.2 大白菜AP2結(jié)構(gòu)域基本信息23-25
• 2.2.3 大白菜AP2亞家族基因結(jié)構(gòu)25
• 2.2.4 大白菜AP2亞家族簡(jiǎn)單重復(fù)序列基本信息25-26
• 2.2.5 大白菜亞家族成員共線性信息26-27
• 2.2.6 大白菜AP2亞家族染色體定位27-28
• 2.2.7 大白菜AP2亞家族氨基酸序列比對(duì)分析28-29
• 2.2.8 AP2亞家族系統(tǒng)進(jìn)化分析29-30
• 2.2.9 大白菜AP2亞家族進(jìn)化樹及模體分析30-32
• 2.2.10 大白菜AP2亞家族基因表達(dá)模式分析32-33
• 2.3 小結(jié)33-35
• 第三章 大白菜Br ANT基因克隆與功能分析35-57
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 試驗(yàn)材料35
• 3.1.2 大腸桿菌、農(nóng)桿菌菌株和載體35-36
• 3.1.3 生化試劑36
• 3.2 方法36-45
• 3.2.1 植物組織DNA提取36
• 3.2.2 RNA提取36-37
• 3.2.3 反轉(zhuǎn)錄37
• 3.2.4 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)參數(shù)37-38
• 3.2.5 DNA膠回收38
• 3.2.6 質(zhì)粒提取38-39
• 3.2.7 目的基因克隆39-40
• 3.2.8 目的基因轉(zhuǎn)化克隆載體40-41
• 3.2.9 超表達(dá)載體構(gòu)建41-42
• 3.2.10 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化42
• 3.2.11 農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)化42-44
• 3.2.12 轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選44
• 3.2.13 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株44
• 3.2.14 轉(zhuǎn)基因植株表型形狀研究44-45
• 3.3 結(jié)果與分析45-55
• 3.3.1 基因克隆45
• 3.3.2 大白菜Br ANT基因家族表達(dá)模式分析45-48
• 3.3.3 轉(zhuǎn)基因株系目的基因表達(dá)分析48-49
• 3.3.4 轉(zhuǎn)基因植株幼苗表型分析49-51
• 3.3.5 轉(zhuǎn)基因（35s:Br ANT2）擬南芥成熟期表型分析51-53
• 3.3.6 溫度脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗影響53-54
• 3.3.7 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗影響54-55
• 3.4 討論55-57
• 第四章 轉(zhuǎn)基因（35S:Br ANT2）擬南芥轉(zhuǎn)錄組分析57-75
• 4.1 材料57
• 4.1.1 試驗(yàn)材料57
• 4.1.2 生化試劑57
• 4.2 方法57-62
• 4.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄57
• 4.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序57
• 4.2.3 文庫(kù)構(gòu)建57-58
• 4.2.4 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)及上機(jī)測(cè)序58
• 4.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)及其質(zhì)量控制58-59
• 4.2.6 測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析59-61
• 4.2.7 差異表達(dá)基因的熒光實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證61
• 4.2.8 差異表達(dá)基因的GO功能顯著性富集分析61-62
• 4.3 結(jié)果與分析62-72
• 4.3.1 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析62-65
• 4.3.2 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)分析65-66
• 4.3.3 基因表達(dá)模式分析66-70
• 4.3.4 差異表達(dá)基因的RT-q PCR驗(yàn)證70-72
• 4.4 討論72-75
• 4.4.1 參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的差異表達(dá)基因72-73
• 4.4.2 光形態(tài)建成相關(guān)差異表達(dá)基因73
• 4.4.3 生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)基因73-74
• 4.4.4 編碼鈣信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白的差異表達(dá)基因74
• 4.4.5 衰老相關(guān)蛋白的差異表達(dá)基因74-75
• 第五章 結(jié)論75-76
• 附錄1：真核克隆載體pMD 18-T圖譜76-77
• 附錄2：過量表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS圖譜77-78
• 附錄3：DNA、RNA質(zhì)量檢測(cè)圖片78-79
• 附錄4：PMD18-T- Br ANT2和pCAMBIA-35S-OCS空載體的雙酶切79-80
• 附錄5：pCAMBIA-35S-OCS-Br ANT2菌落PCR及雙酶切檢測(cè)80-81
• 附錄6：轉(zhuǎn)基因植株純合體篩選81-82
• 參考文獻(xiàn)82-96
• 致謝96-97
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介97-98
• 作者簡(jiǎn)介98-99

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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5 孫姝t，

本文編號(hào)：624163