LH誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)過程中相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究
本文關(guān)鍵詞:LH誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)過程中相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究
更多相關(guān)文章: 卵母細(xì)胞成熟 條件性基因敲除小鼠 c GMP CNP EGFR
【摘要】:哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞自出生前后到性成熟LH峰以前,一直停滯于第一次減數(shù)分裂前期。卵巢顆粒細(xì)胞分泌的CNP通過受體NPR2調(diào)控卵母細(xì)胞內(nèi)高水平的c GMP是阻滯卵母細(xì)胞成熟的主要原因,LH峰出現(xiàn)后激活了EGF/EGFR信號通路,卵母細(xì)胞內(nèi)c GMP水平下降,減數(shù)分裂恢復(fù)。由此可見,CNP/NPR2和EGF/EGFR信號通路對c GMP水平的調(diào)控是卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵。但目前關(guān)于FSH和LH對CNP/NPR2和EGF/EGFR通路具體的調(diào)控機(jī)理,以及這兩條通路在LH介導(dǎo)的c GMP下調(diào)過程中所發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究采用EGFR基因敲除小鼠作為主要研究對象,運(yùn)用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色、實(shí)時(shí)定量PCR、酶聯(lián)免疫分析法、放射免疫分析法、Western Blot等技術(shù),從卵巢、卵泡、卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體和卵母細(xì)胞發(fā)育等方面,研究卵母細(xì)胞成熟過程中參與c GMP水平調(diào)控的相關(guān)信號通路以及各通路之間的關(guān)系。本研究所取得的主要結(jié)果如下:1.本試驗(yàn)中主要選用的遺傳背景為C57BL/6J×129Sv的小鼠對促性腺激素應(yīng)答效果良好,卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育正常。研究發(fā)現(xiàn),22~24日齡C57BL/6J×129Sv野生型小鼠在PMSG(5 IU)誘導(dǎo)44~48 h后,卵巢表面獲得的排卵前卵泡數(shù)量較多,卵泡內(nèi)EGFR表達(dá)水平與分布正常;h CG繼續(xù)誘導(dǎo)12 h后,輸卵管內(nèi)收集到大量MII期的卵母細(xì)胞,IVF的受精率偏低,但受精后胚胎發(fā)育良好,形態(tài)正常;IVM的自發(fā)成熟率較高,染色體形態(tài)規(guī)則。~2.卵母細(xì)胞成熟在Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠中被顯著抑制。Western Blot結(jié)果表明,Egfrfl/flCyp19Cre/+和Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)EGFR蛋白水平顯著下降,分別為對照組的35%和15%左右。應(yīng)用PMSG和h CG進(jìn)行超數(shù)排卵處理后,卵巢內(nèi)的卵丘細(xì)胞緊緊包圍卵母細(xì)胞,透明質(zhì)酸酶很難將其從卵母細(xì)胞上剝離;Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠相對于對照組仍有60%左右處于GV期;此時(shí)從Egfrfl/flCyp19Cre/+和Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠輸卵管壺腹部收集到的卵母細(xì)胞數(shù)量都有明顯降低,尤其是Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠,僅為對照組的18%左右,且成功排卵的卵母細(xì)胞中,部分仍處于GV期,Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠高達(dá)50%以上。3.卵巢顆粒細(xì)胞中CNP的產(chǎn)生受FSH的正調(diào)控和LH的負(fù)調(diào)控。通過對鈉肽家族表達(dá)過程進(jìn)行全基因組水平實(shí)時(shí)監(jiān)測以及進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的研究發(fā)現(xiàn),FSH和LH/h CG僅對NPPC具有調(diào)控作用,而對NPPA和NPPB沒有影響,且FSH上調(diào)NPPC表達(dá),LH/h CG抑制NPPC表達(dá)。受體NPR2在壁層顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中都有表達(dá),在卵丘細(xì)胞略高,FSH/PMSG引起了NPR2 m RNA的緩慢提高,44 h后顯著下降,LH/h CG處理3 h后抑制其表達(dá)。CNP對于體外培養(yǎng)的卵泡中LH介導(dǎo)的卵母細(xì)胞GVBD沒有影響,但可有效促進(jìn)體外培養(yǎng)的壁層顆粒細(xì)胞中c GMP的產(chǎn)生和抑制體外培養(yǎng)的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中卵母細(xì)胞GVBD的發(fā)生。體外培養(yǎng)的壁層顆粒細(xì)胞中,LH/h CG抑制了CNP誘導(dǎo)的c GMP的產(chǎn)生過程,即降低了壁層顆粒細(xì)胞對CNP的敏感性。此外,Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠中,NPPC的表達(dá)仍響應(yīng)LH調(diào)控發(fā)生了顯著的下降,與野生型小鼠表現(xiàn)一致,說明EGFR的缺失不影響LH對NPPC的調(diào)控作用。4.EGF/EGFR通路調(diào)控LH介導(dǎo)的c GMP的早期迅速下降,但對于LH依賴性NPPC m RNA表達(dá)下調(diào)不是必要的。在活體和離體情況下,LH/h CG處理都導(dǎo)致了c GMP水平和NPPC m RNA的顯著下降,但c GMP的下調(diào)非常迅速,早于NPPC m RNA的下降1 h以上。體外培養(yǎng)的小鼠卵泡經(jīng)EGF樣生長因子Areg處理后,卵泡中NPPC m RNA的表達(dá)受到抑制,等同于LH的抑制效果;并且Areg的抑制作用被EGFR激酶抑制劑AG1478完全阻止,但LH依賴性NPPC表達(dá)抑制對AG1478不敏感。卵泡中LH對NPPC的抑制作用在4類EGFR信號通路缺陷小鼠中也未受到影響,進(jìn)一步表明,LH依賴性NPPC m RNA表達(dá)調(diào)控不是通過EGFR信號通路介導(dǎo)的。采用AG1478抑制體外培養(yǎng)的卵泡內(nèi)EGFR的效應(yīng)后,早期LH對c GMP水平的迅速下調(diào)被完全抑制;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),EGFR在LH誘導(dǎo)15~30 min內(nèi)即發(fā)生了顯著的磷酸化,表明EGF/EGFR參與了c GMP的早期調(diào)控,而配體CNP可能作用于后期的反應(yīng)。Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠體外培養(yǎng)的排卵前卵泡中,c GMP的水平在LH誘導(dǎo)后發(fā)生了迅速的部分下降,但該下降不足以引發(fā)卵母細(xì)胞的GVBD。綜上所述,本文選用在卵巢顆粒細(xì)胞中特異性敲除EGFR基因的小鼠模型,從細(xì)胞、組織和活體水平驗(yàn)證了CNP/NPR2和EGF/EGFR信號通路在卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中的關(guān)鍵調(diào)控作用。該過程中,c GMP水平受多條冗余信號通路的調(diào)控。EGF/EGFR通路調(diào)控LH介導(dǎo)的c GMP的早期迅速下降,對于卵母細(xì)胞成熟是必需的。本研究為理解卵母細(xì)胞的成熟調(diào)控提供了必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為臨床上卵母細(xì)胞相關(guān)的不孕不育癥的預(yù)防和治療提供了新的研究思路。
【關(guān)鍵詞】:卵母細(xì)胞成熟 條件性基因敲除小鼠 c GMP CNP EGFR
【學(xué)位授予單位】:西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號】:S814
【目錄】:
- 摘要6-8
- ABSTRACT8-15
- 上篇 文獻(xiàn)綜述15-35
- 第一章 小鼠卵母細(xì)胞成熟調(diào)控的研究進(jìn)展15-35
- 1.1 卵泡發(fā)育與卵母細(xì)胞成熟15-18
- 1.1.1 卵巢的結(jié)構(gòu)與發(fā)育15-16
- 1.1.2 卵母細(xì)胞的發(fā)育過程16-17
- 1.1.3 卵泡各類體細(xì)胞與卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系17
- 1.1.4 激素控制與卵巢周期17-18
- 1.2 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停滯與恢復(fù)18-21
- 1.2.1 卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂停滯20-21
- 1.2.2 卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)21
- 1.3 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯與恢復(fù)的調(diào)控機(jī)理21-33
- 1.3.1 cAMP、cGMP和PDE3A在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用22-24
- 1.3.2 細(xì)胞間隙連接在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用24-25
- 1.3.3 CNP/NPR2 信號網(wǎng)絡(luò)在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用25-29
- 1.3.4 EGF信號網(wǎng)絡(luò)在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用29-33
- 1.4 研究目的與意義33-34
- 1.5 研究思路與方法34-35
- 下篇 試驗(yàn)研究35-98
- 第二章 試驗(yàn)用小鼠卵母細(xì)胞成熟與體外受精的測定35-44
- 2.1 引言35-36
- 2.2 材料與方法36-39
- 2.2.1 儀器用具36
- 2.2.2 材料試劑36
- 2.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物36-37
- 2.2.4 切片制備與蘇木精-伊紅(HE)染色37
- 2.2.5 超數(shù)排卵后卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的分離37
- 2.2.6 免疫組織化學(xué)法37-38
- 2.2.7 小鼠卵母細(xì)胞的IVF和胚胎的體外培養(yǎng)38
- 2.2.8 卵母細(xì)胞的IVM38-39
- 2.2.9 卵母細(xì)胞免疫熒光法39
- 2.3 結(jié)果與分析39-43
- 2.3.1 PMSG處理后卵母細(xì)胞的發(fā)育39-40
- 2.3.2 小鼠卵母細(xì)胞的IVF和胚胎的體外培養(yǎng)40-41
- 2.3.3 卵母細(xì)胞的IVM與染色體形態(tài)觀察41-43
- 2.4 討論43
- 2.5 小結(jié)43-44
- 第三章 EGF/EGFR系統(tǒng)相關(guān)基因敲除鼠的繁育與鑒定44-62
- 3.1 引言44
- 3.2 材料與方法44-50
- 3.2.1 儀器用具44
- 3.2.2 材料試劑44-45
- 3.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物45
- 3.2.4 配種方案45-47
- 3.2.5 基因型鑒定47-48
- 3.2.6 排卵前卵泡的分離與培養(yǎng)48-49
- 3.2.7 卵巢顆粒細(xì)胞的分離49
- 3.2.8 Western Blot檢測蛋白表達(dá)水平49-50
- 3.2.9 切片制備與HE染色50
- 3.2.10 超數(shù)排卵后卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的分離50
- 3.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析50
- 3.3 結(jié)果與分析50-60
- 3.3.1 小鼠的基因型鑒定50-52
- 3.3.2 Egfrfl/flCyp19Cre/+小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)表型的研究52-55
- 3.3.3 Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)表型的研究55-60
- 3.4 討論60-61
- 3.5 小結(jié)61-62
- 第四章 CNP/NPR2 在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的作用研究62-78
- 4.1 引言62
- 4.2 材料與方法62-65
- 4.2.1 儀器用具62
- 4.2.2 材料試劑62-63
- 4.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物63
- 4.2.4 人卵泡液樣品的收集63
- 4.2.5 人卵巢壁層顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)63-64
- 4.2.6 小鼠排卵前卵泡的分離與培養(yǎng)64
- 4.2.7 RNA提取和q PCR檢測64
- 4.2.8 CNP蛋白水平的RIA檢測64-65
- 4.2.9 cGMP水平的EIA檢測65
- 4.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析65
- 4.3 結(jié)果與分析65-75
- 4.3.1 小鼠卵巢中FSH對NPPC表達(dá)有正調(diào)控作用而LH/hCG為負(fù)調(diào)控作用65-68
- 4.3.2 促性腺激素對CNP受體NPR2 的表達(dá)調(diào)控68-69
- 4.3.3 促性腺激素對CNP蛋白水平的表達(dá)調(diào)控69-71
- 4.3.4 CNP對cGMP水平以及卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控71-74
- 4.3.5 LH/hCG信號降低壁層顆粒細(xì)胞對CNP誘導(dǎo)的敏感性74-75
- 4.3.6 CNP/NPR2 信號在EGFR顆粒細(xì)胞特異性敲除小鼠中的表達(dá)75
- 4.4 討論75-77
- 4.5 小結(jié)77-78
- 第五章 卵泡中LH介導(dǎo)的CNP和EGF信號通路對CGMP和卵母細(xì)胞成熟的影響78-98
- 5.1 引言78-79
- 5.2 材料與方法79-81
- 5.2.1 儀器用具79
- 5.2.2 材料試劑79
- 5.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物79
- 5.2.4 cGMP水平的EIA檢測79-80
- 5.2.5 排卵前卵泡的分離與培養(yǎng)80
- 5.2.6 卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外培養(yǎng)80
- 5.2.7 RNA提取與q PCR檢測80
- 5.2.8 Western Blot檢測蛋白表達(dá)水平80-81
- 5.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析81
- 5.3 結(jié)果與分析81-94
- 5.3.1 LH/hCG體內(nèi)和體外誘導(dǎo)卵泡內(nèi)c GMP下降81-82
- 5.3.2 LH處理后體外培養(yǎng)的排卵前卵泡中的NPPC mRNA水平82-83
- 5.3.3 體外培養(yǎng)的排卵前卵泡中EGF信號通路對NPPC mRNA相對水平的影響83-85
- 5.3.4 信號通路對LH依賴性cGMP抑制的影響85-87
- 5.3.5 rLH處理Egfrdelta/fl Cyp19Cre/+小鼠排卵前卵泡對cGMP水平的影響87-91
- 5.3.6 EGFR在野生型和Egfrdelta/flCyp19Cre/+小鼠中的表達(dá)和激活91-93
- 5.3.7 LH/hCG對CNP依賴性cGMP產(chǎn)生的影響93-94
- 5.4 討論94-97
- 5.5 小結(jié)97-98
- 研究結(jié)論98-99
- 創(chuàng)新點(diǎn)99-100
- 下一步研究工作100-101
- 參考文獻(xiàn)101-113
- 縮略詞表113-115
- 致謝115-116
- 個(gè)人簡介116
- 發(fā)表學(xué)術(shù)論文116-117
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7 劉紅;新生大鼠卵母細(xì)胞凋亡信號通路調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究[D];汕頭大學(xué);2009年
8 錢云;卵母細(xì)胞的體外成熟及其分子生物學(xué)機(jī)制的初步研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年
9 馮貴雪;卵母細(xì)胞體外成熟及人胚胎玻璃化冷凍的研究[D];廣西大學(xué);2006年
10 張建新;牛完全體外生產(chǎn)胚胎及胚胎性別鑒定取樣方法研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年
中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條
1 周洪彬;卵母細(xì)胞成熟抑制劑對豬卵母細(xì)胞成熟的影響[D];西南大學(xué);2006年
2 盧曉麗;鎘抑制卵母細(xì)胞MI期進(jìn)程中MPF的活性及其相關(guān)基因的表達(dá)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年
3 沈江鵬;不同形態(tài)卵母細(xì)胞與不同濃度精子組合對受精及早期胚胎發(fā)育的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年
4 張光利;小鼠死后滯留對卵巢卵母細(xì)胞存活與成熟的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年
5 程立立;卵母細(xì)胞分泌因子在人MⅡ卵母細(xì)胞的卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及其與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能關(guān)系的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年
6 岑文;豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)及孤雌胚胎體外培養(yǎng)的研究[D];陜西師范大學(xué);2015年
7 郭曉英;不同培養(yǎng)因素對犬IVM卵母細(xì)胞形態(tài)和發(fā)育能力的影響[D];延邊大學(xué);2010年
8 邱志芳;牛早期卵母細(xì)胞和成熟前后的超微結(jié)構(gòu)變化[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年
9 王剛;低溫聯(lián)合高濃度的丙酮酸對排卵后卵母細(xì)胞老化的抑制作用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年
10 許衛(wèi)華;牛卵泡卵母細(xì)胞冷凍保存的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年
本文關(guān)鍵詞:LH誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)過程中相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究
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