本文關鍵詞：J亞群禽白血病病毒多表位蛋白質疫苗和DNA疫苗的構建及免疫效果評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：J亞群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)首次分離于上個世紀80年代的英國,是外源性ALV與宿主內源性序列EAV-HP的重組體。ALV-J感染后會導致高發(fā)病率、雞體生長遲緩和腫瘤,給全世界的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失。盡管一些國家的種禽公司已經成功實現(xiàn)了種雞群ALV-J的凈化工作,但是由于ALV在養(yǎng)雞業(yè)的廣泛流行、我國養(yǎng)殖模式的多樣化、規(guī)模參差不齊等特點,在我國地方種雞群中進行ALV-J的凈化工作還是一項巨大的挑戰(zhàn)。J亞群禽白血病的高發(fā)病率和宿主范圍的廣泛性使其成為獸醫(yī)工作者持續(xù)關注的焦點。疫苗免疫是一種劃算可行的控制臨床疾病的有效方式。ALV是一種主要通過垂直傳播的疾病,在宿主體內容易引起免疫耐受而很難誘導特異性抗體的產生,給疫苗研究造成了很大的困難,目前尚無可用的ALV商品化疫苗。因此,研制一種有效、安全的疫苗來預防ALV-J的廣泛流行迫在眉睫。研究表明,單一抗原的免疫原性較差且誘導的免疫保護有限。一種以表位為基礎的包含病原體多個保護性抗原表位的多表位疫苗可以克服這些缺點。本研究中我們設計和構建了一個基于ALV-J NX0101毒株的嵌合多表位基因來制備相應的多表位疫苗,并評估了其在雞體內的免疫效果及攻毒保護率,期望其誘導的免疫應答能抵抗ALV-J的感染,為探索ALV-J疫苗的研制提供方法和思路。1、嵌合多表位基因的設計和構建通過生物信息學軟件及相關網站分析ALV-J中國典型毒株NX0101三個主要結構基因gag、pol和env所編碼蛋白的B細胞和T細胞表位,根據親水性、柔韌性、二級結構、表面可及性等選擇標準,同時比較近幾年ALV-J流行毒株的同源性,結合相關文獻的研究報道,篩選出4段抗原表位集中且序列保守的區(qū)域Gag(278-376aa),Pol(784-855aa),Env(Gp85:145-156aa和Gp37:412-538aa)以柔性肽GAGS作為Linker,將篩選的4段抗原表位基因依次串聯(lián)成一條全新的嵌合多表位基因X。分析表明,構建的嵌合多表位基因X有良好的親水性、柔性及抗原性等,國內外未見報道,該研究豐富了ALV-J結構蛋白的生物信息學資料,為ALV-J嵌合多表位基因的原核表達及DNA疫苗的制備提供了基礎材料。2、嵌合多表位基因的原核表達和特異性檢測將構建的嵌合多表位基因X用Eco RI和Not I雙酶切后克隆入表達載體PET-30a(+)進行原核表達研究。通過優(yōu)化表達條件,確定了重組嵌合多表位蛋白X(r CMEPX)表達的最佳誘導溫度為37℃,誘導時間為4 h,IPTG濃度為0.5 m M/m L。用臨床ALV-J陽性血清和陰性血清進行Western-blots分析,結果證明r CMEPX表達成功并且能與臨床ALV-J陽性血清發(fā)生特異性反應。間接ELISA實驗評估了r CMEPX與臨床ALV-J陽性血清反應的反應原性、特異性和敏感性。以純化的r CMEPX為抗原包被酶標板,篩選出r CMEPX的最佳包被濃度為0.125μg/m L,抗體最佳稀釋度為1:40,酶標二抗(HRP標記羊抗雞Ig G)的最佳稀釋度為1:5000,血清樣品的陰陽性臨界值為0.152,以上實驗結果表明r CMEPX有良好的免疫反應性,為ALV-J蛋白質疫苗的研制奠定了基礎。3、嵌合多表位基因DNA疫苗的制備將嵌合多表位基因X克隆入真核表達載體p VAX1來評估其作為DNA疫苗的潛力。重組質粒經酶切和測序鑒定真核表達質粒構建正確后,通過脂質體2000轉染DF-1細胞,利用間接免疫熒光檢測重組真核質粒在體外的表達。結果顯示,轉染了p VAX1-X的DF-1細胞胞漿呈現(xiàn)特異性的綠色熒光而轉染了p VAX1質粒的細胞無綠色熒光出現(xiàn),表明嵌合多表位基因能在真核細胞中得到表達。大量提取并純化重組真核質粒為ALV-J嵌合多表位基因DNA疫苗的制備提供了試驗材料。4、嵌合多表位基因相關疫苗的制備及免疫效果評價將構建的嵌合多表位基因X分別制備相應的蛋白質疫苗(r CMEPX)和DNA疫苗(p VAX-X)并評價了這兩種疫苗在雞體內的免疫效果和攻毒保護率。結果表明該嵌合多表位蛋白質疫苗(r CMEPX)和DNA疫苗(p VAX-X)均能誘導良好的體液免疫和細胞免疫反應,免疫雞的攻毒保護率分別為80%和70%。用DNA疫苗初次免疫,蛋白質疫苗加強免疫的這種“prime-boost”策略,通過檢測免疫雞體液免疫和細胞免疫的各種指標,證明能有效增強該ALV-J DNA疫苗的免疫效果。本論文開展的ALV-J嵌合多表位基因相關疫苗的構建及免疫研究,為研制安全、高效的ALV-J疫苗提供了思路和基礎材料。
【關鍵詞】：J亞群禽白血病病毒 嵌合多表位基因 原核表達 DNA疫苗 細胞免疫 免疫評價
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要11-13
• Abstract13-16
• 1 前言16-31
• 1.1 禽白血病簡介16-19
• 1.1.1 ALV-J病毒的結構特征17-18
• 1.1.2 流行病學18-19
• 1.2 ALV-J的檢測和診斷19-21
• 1.2.1 病毒的分離和鑒定19-20
• 1.2.2 血清學檢測20
• 1.2.3 聚合酶鏈式反應（PCR）技術20-21
• 1.3 致腫瘤機制21
• 1.4 ALV引起的免疫抑制21-22
• 1.5 ALV-J的防治22-23
• 1.6 疫苗研究23-29
• 1.6.1 細胞表位24-26
• 1.6.2 表位疫苗的研究進展26
• 1.6.3 脂肽疫苗26-27
• 1.6.4 復合多價表位肽疫苗27
• 1.6.5 表位DNA疫苗27
• 1.6.6 “prime-boost”免疫策略27-28
• 1.6.7 Cp G免疫佐劑的研究進展28-29
• 1.6.8 前景展望29
• 1.7 本研究的目的及意義29-31
• 2 材料和方法31-67
• 2.1 材料31-33
• 2.1.1 數(shù)據庫、生物信息學軟件31
• 2.1.2 病毒和細胞31
• 2.1.3 質粒載體和工程菌31
• 2.1.4 工具酶31
• 2.1.5 抗體及血清31
• 2.1.6 主要試劑31-32
• 2.1.7 主要耗材32
• 2.1.8 儀器與設備32-33
• 2.2 方法33-67
• 2.2.1 主要試劑配制33-37
• 2.2.1.1 細胞培養(yǎng)試劑33
• 2.2.1.2 細菌培養(yǎng)試劑33-34
• 2.2.1.3 SDS-PAGE和Wbstern blot試劑34-35
• 2.2.1.4 包涵體洗滌及純化的主要溶液35-36
• 2.2.1.5 間接ELISA試劑36
• 2.2.1.6 組織細胞DNA與RNA提取及大量提取重組真核表達質粒的試劑36-37
• 2.2.2 ALV-J三個主要結構基因抗原表位集中區(qū)的預測篩選及嵌合基因的克隆37-45
• 2.2.2.1 ALV-J三個主要結構蛋白抗原表位的預測分析37
• 2.2.2.2 ALV-J代表毒株的同源性比對及抗原表位集中區(qū)的篩選37
• 2.2.2.3 嵌合多表位基因的構建37-38
• 2.2.2.4 擴增四段抗原表位集中區(qū)基因的引物38
• 2.2.2.5 Xl-X4基因片段的獲取38-42
• 2.2.2.6 嵌合基因X克隆載體的構建42-45
• 2.2.2.7 嵌合多表位基因X的生物信息學分析45
• 2.2.3 ALV-J嵌合多表位基因X的原核表達研究45-54
• 2.2.3.1 嵌合多表位基因X原核表達載體的構建45-48
• 2.2.3.2 p ET-30a(+)-X的原核表達48-50
• 2.2.3.3 嵌合基因X最佳表達條件的確定50-51
• 2.2.3.4 重組包涵體蛋白的變性與復性51-52
• 2.2.3.5 檢測重組蛋白抗體的間接ELISA方法的建立52-54
• 2.2.4 嵌合多表位基因DNA疫苗的制備54-58
• 2.2.4.1 嵌合基因X真核表達載體的構建54-56
• 2.2.4.2 嵌合多表位基因X真核表達的檢測56-58
• 2.2.5 嵌合基因X相關疫苗的免疫研究58-67
• 2.2.5.1 實驗動物58
• 2.2.5.2 免疫原58
• 2.2.5.3 疫苗的免疫研究58-63
• 2.2.5.4 疫苗的攻毒保護實驗63-67
• 3 結果67-85
• 3.1 ALV-J嵌合多表位基因X的設計及克隆載體的構建67-72
• 3.1.1 ALV-J三個主要結構蛋白抗原表位的預測結果67-68
• 3.1.2 抗原表位集中基因片段的確定及獲得68-70
• 3.1.3 嵌合多表位基因X的構建70-71
• 3.1.4 重組克隆質粒的鑒定71-72
• 3.1.5 嵌合多表位基因X的結構特征分析72
• 3.2 嵌合多表位基因X的原核表達研究72-78
• 3.2.1 重組表達載體p ET-30a(+)-X的鑒定72-73
• 3.2.2 重組蛋白的SDS-PAGE及Western b1ots檢測73-74
• 3.2.3 原核表達條件的優(yōu)化74-75
• 3.2.4 重組蛋白檢測特異性抗體的間接ELISA方法的建立75-78
• 3.2.4.1 最佳抗原包被濃度和抗血清稀釋度的確定75-76
• 3.2.4.2 酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)的確定76
• 3.2.4.3 間接ELISA方法陰陽性臨界值的確定76-77
• 3.2.4.4 敏感性試驗77
• 3.2.4.5 特異性試驗77-78
• 3.3 嵌合多表位基因DNA疫苗的制備78-80
• 3.3.1 重組p VAX-X質粒的鑒定78-79
• 3.3.2 重組真核質粒的大量提取和純化79-80
• 3.3.3 間接免疫熒光檢測pVAX-X質粒的表達產物80
• 3.4 疫苗免疫效果評估80-85
• 3.4.1 各組免疫雞的抗體水平80-81
• 3.4.2 各組免疫雞的外周血CD4+、CD8+ T淋巴細胞比率81-82
• 3.4.3 間接免疫熒光實驗檢測抗血清與ALV-J的特異性結合82
• 3.4.4 特異性中和抗體水平82-83
• 3.4.5 ELISA法檢測IFN-γ和IL-4 細胞因子83-84
• 3.4.6 病毒血癥的檢測結果84
• 3.4.7 泄殖腔棉拭子p27抗原的檢測結果84
• 3.4.8 實驗雞病毒感染的檢測結果84-85
• 4 討論85-91
• 4.1 設計和構建嵌合多表位基因85-86
• 4.2 原核表達嵌合多表位基因86-88
• 4.3 真核表達嵌合多表位基因88-89
• 4.4 嵌合多表位基因相關疫苗的免疫保護效果89-91
• 5 結論91-92
• 6 參考文獻92-106
• 致謝106-107
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文107

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前10條

1 孟松樹,張紹杰,童光志;雞傳染性喉氣管炎病毒DNA疫苗免疫效果觀察[J];中國預防獸醫(yī)學報;2000年03期

2 何宏軒,張西臣,尹繼剛,李建華,楊舉,劉明遠,宣華;用微小隱孢子蟲子孢子表面蛋白DNA疫苗免疫小鼠的實驗研究[J];中國獸醫(yī)雜志;2003年02期

3 郭志儒;第一個獲準上市的DNA疫苗[J];中國獸醫(yī)學報;2005年05期

4 石軍,陳安國,洪奇華;魚類的DNA疫苗[J];中國獸醫(yī)雜志;2003年12期

5 汪洋;易力;王紅寧;王淑芳;李宏偉;;高密度培養(yǎng)重組菌生產雞傳染性支氣管炎DNA疫苗[J];安徽農業(yè)科學;2006年09期

6 郭志儒;DNA疫苗免疫新途徑[J];中國獸醫(yī)學報;2001年03期

7 夏春玲;胡棟友;郭學軍;崔磊;;DNA疫苗及其在動物傳染病中的應用[J];中國家禽;2005年S1期

8 程從升,王文成,李素,扈榮良,涂長春,劉建文,江禹,徐興然;豬瘟DNA疫苗在豬體及環(huán)境的生物安全性研究[J];微生物學報;2005年02期

9 謝榮輝;萬旺軍;李龍;李建榮;于漣;;雞白細胞介素2口服免疫佐劑增強傳染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究[J];浙江大學學報(農業(yè)與生命科學版);2007年03期

10 汪洋;易力;王紅寧;;用于DNA疫苗的質粒大規(guī)模純化研究進展[J];中國獸醫(yī)雜志;2008年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據庫 前10條

1 張曉明;焦新安;潘志明;張小榮;劉秀梵;;非抗性篩選DNA疫苗載體及其沙門氏菌運送系統(tǒng)的研制[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立20周年慶典暨第十次學術研討會論文集（下）[C];2003年

2 于漣;李建榮;黃耀偉;孟松樹;鄭筱祥;;傳染性法氏囊病病毒系列DNA疫苗的免疫原性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十一次學術研討會論文集[C];2002年

3 楊恒;曹三杰;黃小波;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒DNA疫苗的構建與免疫原性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2009學術年會論文集（下冊）[C];2009年

4 王開宇;郭瀛軍;張術;王凱慧;陳祖歡;孫樹漢;;16s rRNA基因探針檢測DNA疫苗制品中殘留宿主基因組DNA[A];首屆長三角科技論壇——長三角生物醫(yī)藥發(fā)展論壇論文集[C];2004年

5 宋小凱;謝昆;嚴若峰;徐立新;李祥瑞;;柔嫩艾美耳球蟲DNA疫苗的構建及其在雞肌肉組織中的表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜寄生蟲學分會第六次代表大會暨第十次學術研討會論文集[C];2009年

6 王賓;謝啟發(fā);;DNA疫苗設計和研究策略[A];中國生物化學與分子生物學會農業(yè)生物化學與分子生物學分會第六次學術交流會論文集[C];2004年

7 王松;孫梅芹;許誠;何清;周陶友;陳守春;趙連三;;體內外檢測乙肝DNA疫苗誘生小鼠特異性CTL活性比較研究[A];第一次全國中西醫(yī)結合傳染病學術會議論文匯編[C];2006年

8 黃欣梅;徐立新;嚴若峰;李祥瑞;;柔嫩艾美耳球蟲免疫調節(jié)型DNA疫苗的免疫保護性實驗[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜寄生蟲學分會第九次學術研討會論文摘要集[C];2006年

9 付潔;董周寰;欒好飛;高新;李靈珍;宋海峰;;肝素酶DNA疫苗經電穿孔免疫在小鼠體內表達和基因組整合研究[A];第九屆全國藥物和化學異物代謝學術會議論文集[C];2009年

10 姜燕;呂昌龍;單風平;徐佳;李成;;Ag85A口服脂質體DNA疫苗的制備與初步活性研究[A];中國免疫學會第五屆全國代表大會暨學術會議論文摘要[C];2006年

中國重要報紙全文數(shù)據庫 前4條

1 ;DNA疫苗“餓”殺小鼠腫瘤[N];醫(yī)藥經濟報;2003年

2 陳勇;西尼羅病毒DNA疫苗開始臨床試驗[N];健康報;2005年

3 董歡霽;新型Aβ DNA疫苗 安全防治阿爾茨海默病[N];醫(yī)藥經濟報;2006年

4 林明貴 金關甫;DNA疫苗 戰(zhàn)勝結核的希望[N];健康報;2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前10條

1 邱蘇贛;共表達霍亂毒素B亞基的DNA疫苗的系統(tǒng)及粘膜佐劑活性研究[D];復旦大學;2013年

2 徐晴晴;J亞群禽白血病病毒多表位蛋白質疫苗和DNA疫苗的構建及免疫效果評價[D];山東農業(yè)大學;2015年

3 王俊霞;犬傳染性肝炎DNA疫苗的構建和免疫原性研究[D];第二軍醫(yī)大學;2007年

4 趙魁;羊傳染性膿皰病毒重組DNA疫苗的構建與實驗免疫研究[D];吉林大學;2010年

5 張含;口服DNA疫苗防治實驗性脈絡膜血管新生[D];中國醫(yī)科大學;2005年

6 李亮助;對白血病化療藥物左旋天冬酰胺酶II的熱穩(wěn)定性改造以及微小殘留白血病DNA疫苗的構建、純化和免疫效果研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2008年

7 李凱;禽網狀內皮組織增生病基因工程亞單位疫苗及DNA疫苗的研制[D];中國農業(yè)科學院;2014年

8 劉燕;抗豬瘟重組活載體疫苗及DNA疫苗的構建及其生物學特性分析[D];中國農業(yè)科學院;2006年

9 李娜;基于甲病毒復制子載體的豬瘟DNA疫苗的構建及免疫效力評價[D];東北農業(yè)大學;2007年

10 王慶敏;增強DNA疫苗免疫效果的策略研究[D];第二軍醫(yī)大學;2003年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前10條

1 王圣超;MHC I-VEGFR2抗原肽單鏈三聚體DNA疫苗的抗腫瘤轉移作用及其機制[D];石河子大學;2015年

2 石昭意;非抗性篩選生長抑素DNA疫苗免疫育肥豬的臨床試驗效果和安全性研究[D];華中農業(yè)大學;2015年

3 王琳;弓形蟲棒狀體蛋白ROP5和ROP7的DNA疫苗免疫小鼠誘導的保護性研究[D];山東大學;2015年

4 趙亞靜;結核分枝桿菌Rv3407重組蛋白、DNA疫苗的制備及其免疫原性的研究[D];河北北方學院;2015年

5 郝妍;以Ag@SiO_2為載體新城疫納米粒DNA疫苗的制備及其免疫效果研究[D];黑龍江大學;2013年

6 蔣英;白細胞介素12對結核病DNA疫苗效應的增強作用[D];重慶醫(yī)科大學;2003年

7 辛娜;人精子特異性乳酸脫氫酶的原核表達、DNA疫苗的構建及其基因免疫效果的初步鑒定[D];福建醫(yī)科大學;2005年

8 王開宇;偽狂犬病、豬瘟、口蹄疫三聯(lián)DNA疫苗的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2005年

9 李曉英;禽傳染性支氣管炎DNA疫苗脂質體、殼聚糖復合物的制備及免疫效果研究[D];四川農業(yè)大學;2006年

10 何添文;雞柔嫩艾美耳球蟲5種免疫調節(jié)型DNA疫苗免疫保護效果的比較[D];南京農業(yè)大學;2007年

  本文關鍵詞：J亞群禽白血病病毒多表位蛋白質疫苗和DNA疫苗的構建及免疫效果評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：505417