本文關(guān)鍵詞：ORFV感染宿主細胞的mRNA表達譜變化及其誘導(dǎo)細胞自噬機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：羊傳染性膿皰病毒（Orf virus，ORFV）是痘病毒科副痘病毒屬的代表種，具有嗜上皮性，綿羊、山羊以及人發(fā)生感染后通常在口、唇等部位皮膚出現(xiàn)丘疹、膿皰等損傷性病變，因此該病又俗稱為“羊口瘡”（Orf）。Orf作為一種人獸共患傳染病，對人類的健康構(gòu)成了嚴重威脅。目前，該病的發(fā)生、流行均呈上升趨勢。宿主感染譜也在逐漸擴大，除感染中小反芻動物外，也不斷有野生動物發(fā)生感染的報道。近年來，研究者對ORFV的基因組結(jié)構(gòu)、免疫特性以及載體應(yīng)用等方面進行了大量的研究；然而，目前仍沒有有效預(yù)防和治療羊傳染性膿皰病的方法和措施。 病毒的感染和致病是一個非常復(fù)雜的過程，病毒侵染宿主后能夠引起易感細胞的一些調(diào)控基因差異表達及其所介導(dǎo)信號通路改變，造成細胞生理功能異常從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，本項目從病毒與宿主相互作用的角度入手，利用Illumina/Solexa測序技術(shù)構(gòu)建羊源原代胚胎鼻甲（ovine fetal turbinate，OFTu）細胞感染ORFV后48h和96h的mRNA表達譜，進行差異表達基因的篩選。在感染病毒后48h，篩選得到了1047個表達上調(diào)基因，366個表達下調(diào)基因；在感染病毒后96h，有1570個基因表達上調(diào)，982個基因表達下調(diào)；GO分析結(jié)果表明，差異基因參與的分子功能主要有催化活性、結(jié)合活性、酶調(diào)節(jié)活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等；參與的生物學(xué)過程主要有免疫過程、生物調(diào)節(jié)過程、代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)等。Pathway分析結(jié)果顯示，所篩選得到的差異表達基因主要參與炎癥、免疫、細胞自噬以及細胞凋亡等相關(guān)通路。該部分研究結(jié)果將為針對ORFV與宿主互作研究的開展提供重要的理論依據(jù)，，并為進一步揭示ORFV致病的分子機制奠定基礎(chǔ)。 近年來，許多研究已經(jīng)證實自噬和病毒感染之間具有直接的作用關(guān)系。然而，ORFV是否能夠誘導(dǎo)細胞自噬卻并未見有報道。我們前期研究對ORFV感染前后差異表達基因進行了篩選鑒定，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了與細胞自噬相關(guān)的差異表達基因如自噬標志性分子LC3表達上調(diào)。細胞自噬是機體一種非常重要的保護和防御機制，能夠?qū)⑹軗p細胞器、胞質(zhì)內(nèi)容物進行循環(huán)再利用，為細胞提供合成底物和能量來維持細胞穩(wěn)態(tài)。因此，我們選擇在生理和病理以及先天性免疫和獲得性免疫過程中發(fā)揮重要作用的自噬作為研究方向。本研究在ORFV感染OFTu細胞或Hela細胞后，利用透射電鏡、間接免疫熒光和免疫印跡分別進行了自噬體形態(tài)學(xué)觀察、內(nèi)源性LC3的定位以及LC3的型別轉(zhuǎn)換的檢測；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ORFV能夠誘導(dǎo)OFTu細胞和Hela細胞自噬體的形成。因為自噬是一個動態(tài)過程不僅包括自噬體的形成，而且還包括自噬體與溶酶體融合運送被降解物到自噬溶酶體降解的過程。因此我們又進一步通過免疫印跡對自噬底物SQSTMl/p62進行了檢測；結(jié)果顯示，ORFV感染宿主細胞（OFTu細胞和Hela細胞）后能夠誘導(dǎo)自噬體和溶酶體融合進而降解自噬底物。 在證實ORFV能夠誘導(dǎo)宿主細胞發(fā)生完整的自噬過程后，本研究用自噬誘導(dǎo)劑（Rapa或EBSS）以及自噬不同時期（早期抑制劑3-MA和晚期抑制劑CQ）的抑制劑處理宿主細胞后，接種ORFV，利用免疫印跡對LC3的型別轉(zhuǎn)換進行了檢測。在有效誘導(dǎo)或抑制自噬后，檢測ORFV的感染滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)自噬或抑制自噬后，ORFV的感染滴度并未發(fā)生明顯變化。這可能是宿主在ORFV入侵時激活了自噬過程進行自我保護，而ORFV可能也會編碼一些蛋白來逃避或抵御宿主抗病毒反應(yīng)。 為了進一步明確ORFV感染誘導(dǎo)宿主細胞自噬的機制。本研究在ORFV感染細胞或Rapamycin處理細胞后，提取細胞總蛋白，進行了免疫印跡分析；結(jié)果顯示，ORFV感染組以及Rapamycin處理組的mTOR的磷酸化水平降低，而LC3-Ⅱ的表達量顯著升高，說明mTOR信號途徑在ORFV誘導(dǎo)細胞自噬過程中具有重要的作用。為了進一步驗證mTOR途徑的抑制是ORFV誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵步驟，我們對Rheb基因進行定點突變后構(gòu)建了能夠激活mTOR活性的Rheb激活形式：pCMV-myc-Rheb Q64L過表達載體。將pCMV-myc-Rheb Q64L轉(zhuǎn)染細胞后，進行免疫印跡分析；結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Rheb Q64L后mTOR的磷酸化水平明顯升高，而LC3-Ⅱ表達量下降；說明Rheb Q64L恢復(fù)了mTOR的活性。在證實ORFV能夠通過抑制mTOR途徑誘導(dǎo)細胞自噬后，我們對mTOR上游的Erk1/2和TSC2的表達變化進行了檢測，發(fā)現(xiàn)ORFV能夠激活TSC2和Erk1/2的活性。用U0126（Erk1/2抑制劑）處理Hela細胞后，接種病毒，免疫印跡分析mTOR、Erk1/2以及TSC2的磷酸化水平；結(jié)果顯示，p-Erk1/2和LC3-Ⅱ的表達量明顯被抑制，而mTOR的磷酸化水平顯著升高，同時，p-TSC2也被抑制。之后，我們將設(shè)計合成的3對靶向TSC2的siRNA（siTSC2-1，siTSC2-2和siTSC2-3）轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)siTSC2-1，siTSC2-2和siTSC2-3的抑制效率分別為73.4%、65.4%和93.1%。將siTSC2-3轉(zhuǎn)染細胞后，接種病毒，免疫印跡分析p-mTOR、p-TSC2以及p-Erk1/2的表達變化；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSC2的磷酸化水平和LC3-Ⅱ的表達量降低，p-mTOR發(fā)生上調(diào)，而p-Erk1/2未出現(xiàn)明顯變化。以上結(jié)果說明ORFV感染宿主后能夠通過激活Erk1/2，使TSC2活化，進而抑制了mTOR的活性，最終誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。以上研究結(jié)果將為進一步研究ORFV的感染特性和分子致病機制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：羊傳染性膿皰病毒 mRNA表達譜 自噬 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 目錄10-12
• 英文縮略詞12-14
• 前言14-16
• 第一篇 文獻綜述16-36
• 第1章 羊傳染性膿皰病毒研究進展16-26
• 1.1 ORFV發(fā)現(xiàn)簡史16
• 1.2 ORFV 基因組16-18
• 1.3 ORFV 免疫機制18-20
• 1.4 ORFV致病機制20-23
• 1.5 ORFV載體應(yīng)用23-24
• 1.6 小結(jié)24-26
• 第2章 自噬的研究進展26-36
• 2.1 自噬的基本過程26-27
• 2.2 自噬類型27-28
• 2.3 自噬的信號調(diào)節(jié)28-29
• 2.4 兩種蛋白降解途徑29-31
• 2.5 病毒與自噬的相互作用31-33
• 2.6 小結(jié)33-36
• 第二篇 研究內(nèi)容36-110
• 第1章 ORFV 感染宿主細胞的差異表達基因篩選和分析36-60
• 1.1 材料36-39
• 1.2 方法39-41
• 1.3 結(jié)果41-55
• 1.4 討論55-58
• 1.5 小結(jié)58-60
• 第2章 ORFV 感染誘導(dǎo)宿主細胞自噬60-76
• 2.1 材料60-64
• 2.2 方法64-67
• 2.2.1 透射電鏡觀察64
• 2.2.2 間接免疫熒光觀察64-65
• 2.2.3 免疫印跡65-66
• 2.2.4 統(tǒng)計分析66-67
• 2.4 結(jié)果67-72
• 2.5 討論72-74
• 2.6 小結(jié)74-76
• 第3章 細胞自噬對羊傳染性膿皰病毒復(fù)制的影響76-86
• 3.1 材料76-78
• 3.2 方法78-80
• 3.3 結(jié)果80-83
• 3.3.1 Rapamycin 或 EBSS 誘導(dǎo)細胞自噬80
• 3.3.2 3 -MA 或 CQ 抑制細胞自噬80-81
• 3.3.3 誘導(dǎo)或抑制自噬對 ORFV 復(fù)制的影響81-82
• 3.3.4 不同藥物對細胞毒性的檢測結(jié)果82-83
• 3.4 討論83-84
• 3.5 小結(jié)84-86
• 第4章 ORFV 感染誘導(dǎo)細胞自噬的機制研究86-110
• 4.1 材料86-89
• 4.2 方法89-96
• 4.3 結(jié)果96-106
• 4.4 討論106-108
• 4.5 小結(jié)108-110
• 結(jié)論110-112
• 參考文獻112-130
• 導(dǎo)師簡介130-132
• 攻讀博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文132-133
• 致謝133

【共引文獻】

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本文編號：501079