本文關(guān)鍵詞：ORFV感染宿主細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜變化及其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：羊傳染性膿皰病毒（Orf virus，ORFV）是痘病毒科副痘病毒屬的代表種，具有嗜上皮性，綿羊、山羊以及人發(fā)生感染后通常在口、唇等部位皮膚出現(xiàn)丘疹、膿皰等損傷性病變，因此該病又俗稱為“羊口瘡”（Orf）。Orf作為一種人獸共患傳染病，對(duì)人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前，該病的發(fā)生、流行均呈上升趨勢(shì)。宿主感染譜也在逐漸擴(kuò)大，除感染中小反芻動(dòng)物外，也不斷有野生動(dòng)物發(fā)生感染的報(bào)道。近年來(lái)，研究者對(duì)ORFV的基因組結(jié)構(gòu)、免疫特性以及載體應(yīng)用等方面進(jìn)行了大量的研究；然而，目前仍沒(méi)有有效預(yù)防和治療羊傳染性膿皰病的方法和措施。 病毒的感染和致病是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，病毒侵染宿主后能夠引起易感細(xì)胞的一些調(diào)控基因差異表達(dá)及其所介導(dǎo)信號(hào)通路改變，造成細(xì)胞生理功能異常從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，本項(xiàng)目從病毒與宿主相互作用的角度入手，利用Illumina/Solexa測(cè)序技術(shù)構(gòu)建羊源原代胚胎鼻甲（ovine fetal turbinate，OFTu）細(xì)胞感染ORFV后48h和96h的mRNA表達(dá)譜，進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。在感染病毒后48h，篩選得到了1047個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，366個(gè)表達(dá)下調(diào)基因；在感染病毒后96h，有1570個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，982個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；GO分析結(jié)果表明，差異基因參與的分子功能主要有催化活性、結(jié)合活性、酶調(diào)節(jié)活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等；參與的生物學(xué)過(guò)程主要有免疫過(guò)程、生物調(diào)節(jié)過(guò)程、代謝過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)等。Pathway分析結(jié)果顯示，所篩選得到的差異表達(dá)基因主要參與炎癥、免疫、細(xì)胞自噬以及細(xì)胞凋亡等相關(guān)通路。該部分研究結(jié)果將為針對(duì)ORFV與宿主互作研究的開(kāi)展提供重要的理論依據(jù)，，并為進(jìn)一步揭示ORFV致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 近年來(lái)，許多研究已經(jīng)證實(shí)自噬和病毒感染之間具有直接的作用關(guān)系。然而，ORFV是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬卻并未見(jiàn)有報(bào)道。我們前期研究對(duì)ORFV感染前后差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選鑒定，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞自噬相關(guān)的差異表達(dá)基因如自噬標(biāo)志性分子LC3表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞自噬是機(jī)體一種非常重要的保護(hù)和防御機(jī)制，能夠?qū)⑹軗p細(xì)胞器、胞質(zhì)內(nèi)容物進(jìn)行循環(huán)再利用，為細(xì)胞提供合成底物和能量來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。因此，我們選擇在生理和病理以及先天性免疫和獲得性免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用的自噬作為研究方向。本研究在ORFV感染OFTu細(xì)胞或Hela細(xì)胞后，利用透射電鏡、間接免疫熒光和免疫印跡分別進(jìn)行了自噬體形態(tài)學(xué)觀察、內(nèi)源性LC3的定位以及LC3的型別轉(zhuǎn)換的檢測(cè)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ORFV能夠誘導(dǎo)OFTu細(xì)胞和Hela細(xì)胞自噬體的形成。因?yàn)樽允墒且粋�(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程不僅包括自噬體的形成，而且還包括自噬體與溶酶體融合運(yùn)送被降解物到自噬溶酶體降解的過(guò)程。因此我們又進(jìn)一步通過(guò)免疫印跡對(duì)自噬底物SQSTMl/p62進(jìn)行了檢測(cè)；結(jié)果顯示，ORFV感染宿主細(xì)胞（OFTu細(xì)胞和Hela細(xì)胞）后能夠誘導(dǎo)自噬體和溶酶體融合進(jìn)而降解自噬底物。 在證實(shí)ORFV能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生完整的自噬過(guò)程后，本研究用自噬誘導(dǎo)劑（Rapa或EBSS）以及自噬不同時(shí)期（早期抑制劑3-MA和晚期抑制劑CQ）的抑制劑處理宿主細(xì)胞后，接種ORFV，利用免疫印跡對(duì)LC3的型別轉(zhuǎn)換進(jìn)行了檢測(cè)。在有效誘導(dǎo)或抑制自噬后，檢測(cè)ORFV的感染滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)自噬或抑制自噬后，ORFV的感染滴度并未發(fā)生明顯變化。這可能是宿主在ORFV入侵時(shí)激活了自噬過(guò)程進(jìn)行自我保護(hù)，而ORFV可能也會(huì)編碼一些蛋白來(lái)逃避或抵御宿主抗病毒反應(yīng)。 為了進(jìn)一步明確ORFV感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬的機(jī)制。本研究在ORFV感染細(xì)胞或Rapamycin處理細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行了免疫印跡分析；結(jié)果顯示，ORFV感染組以及Rapamycin處理組的mTOR的磷酸化水平降低，而LC3-Ⅱ的表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明mTOR信號(hào)途徑在ORFV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過(guò)程中具有重要的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證mTOR途徑的抑制是ORFV誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵步驟，我們對(duì)Rheb基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后構(gòu)建了能夠激活mTOR活性的Rheb激活形式：pCMV-myc-Rheb Q64L過(guò)表達(dá)載體。將pCMV-myc-Rheb Q64L轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，進(jìn)行免疫印跡分析；結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Rheb Q64L后mTOR的磷酸化水平明顯升高，而LC3-Ⅱ表達(dá)量下降；說(shuō)明Rheb Q64L恢復(fù)了mTOR的活性。在證實(shí)ORFV能夠通過(guò)抑制mTOR途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后，我們對(duì)mTOR上游的Erk1/2和TSC2的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ORFV能夠激活TSC2和Erk1/2的活性。用U0126（Erk1/2抑制劑）處理Hela細(xì)胞后，接種病毒，免疫印跡分析mTOR、Erk1/2以及TSC2的磷酸化水平；結(jié)果顯示，p-Erk1/2和LC3-Ⅱ的表達(dá)量明顯被抑制，而mTOR的磷酸化水平顯著升高，同時(shí)，p-TSC2也被抑制。之后，我們將設(shè)計(jì)合成的3對(duì)靶向TSC2的siRNA（siTSC2-1，siTSC2-2和siTSC2-3）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)siTSC2-1，siTSC2-2和siTSC2-3的抑制效率分別為73.4%、65.4%和93.1%。將siTSC2-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，接種病毒，免疫印跡分析p-mTOR、p-TSC2以及p-Erk1/2的表達(dá)變化；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSC2的磷酸化水平和LC3-Ⅱ的表達(dá)量降低，p-mTOR發(fā)生上調(diào)，而p-Erk1/2未出現(xiàn)明顯變化。以上結(jié)果說(shuō)明ORFV感染宿主后能夠通過(guò)激活Erk1/2，使TSC2活化，進(jìn)而抑制了mTOR的活性，最終誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。以上研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究ORFV的感染特性和分子致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：羊傳染性膿皰病毒 mRNA表達(dá)譜 自噬 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 目錄10-12
• 英文縮略詞12-14
• 前言14-16
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述16-36
• 第1章 羊傳染性膿皰病毒研究進(jìn)展16-26
• 1.1 ORFV發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)史16
• 1.2 ORFV 基因組16-18
• 1.3 ORFV 免疫機(jī)制18-20
• 1.4 ORFV致病機(jī)制20-23
• 1.5 ORFV載體應(yīng)用23-24
• 1.6 小結(jié)24-26
• 第2章 自噬的研究進(jìn)展26-36
• 2.1 自噬的基本過(guò)程26-27
• 2.2 自噬類型27-28
• 2.3 自噬的信號(hào)調(diào)節(jié)28-29
• 2.4 兩種蛋白降解途徑29-31
• 2.5 病毒與自噬的相互作用31-33
• 2.6 小結(jié)33-36
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容36-110
• 第1章 ORFV 感染宿主細(xì)胞的差異表達(dá)基因篩選和分析36-60
• 1.1 材料36-39
• 1.2 方法39-41
• 1.3 結(jié)果41-55
• 1.4 討論55-58
• 1.5 小結(jié)58-60
• 第2章 ORFV 感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬60-76
• 2.1 材料60-64
• 2.2 方法64-67
• 2.2.1 透射電鏡觀察64
• 2.2.2 間接免疫熒光觀察64-65
• 2.2.3 免疫印跡65-66
• 2.2.4 統(tǒng)計(jì)分析66-67
• 2.4 結(jié)果67-72
• 2.5 討論72-74
• 2.6 小結(jié)74-76
• 第3章 細(xì)胞自噬對(duì)羊傳染性膿皰病毒復(fù)制的影響76-86
• 3.1 材料76-78
• 3.2 方法78-80
• 3.3 結(jié)果80-83
• 3.3.1 Rapamycin 或 EBSS 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬80
• 3.3.2 3 -MA 或 CQ 抑制細(xì)胞自噬80-81
• 3.3.3 誘導(dǎo)或抑制自噬對(duì) ORFV 復(fù)制的影響81-82
• 3.3.4 不同藥物對(duì)細(xì)胞毒性的檢測(cè)結(jié)果82-83
• 3.4 討論83-84
• 3.5 小結(jié)84-86
• 第4章 ORFV 感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制研究86-110
• 4.1 材料86-89
• 4.2 方法89-96
• 4.3 結(jié)果96-106
• 4.4 討論106-108
• 4.5 小結(jié)108-110
• 結(jié)論110-112
• 參考文獻(xiàn)112-130
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介130-132
• 攻讀博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文132-133
• 致謝133

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王光祥;尚佑軍;陳江濤;呂占祿;張克山;劉湘濤;;湖北省羊口瘡病毒的分離鑒定[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年11期

2 田婷婷;李杰;姚運(yùn)亮;李前瑞;許君艷;趙燕青;陳德坤;;羊口瘡病毒滅活疫苗的制備及免疫效果觀察[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年06期

3 柯丹霞;印遇龍;;小G蛋白對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)控[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年08期

4 侯麗穎;孫燕佩;張旭光;趙棟;吳坤;;維生素E琥珀酸酯通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)生保護(hù)性自噬[J];癌變.畸變.突變;2013年05期

5 程玉;李春輝;;胃癌中Cx43與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)性的研究進(jìn)展[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年05期

6 陳松峰;邵增務(wù);;自噬相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J];國(guó)際骨科學(xué)雜志;2013年04期

7 白剛;賈懷杰;何小兵;景志忠;;痘病毒宿主范圍因子及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2013年06期

8 Yu-Shan Chen;Xiao-Bo Qiu;;Ubiquitin at the crossroad of cell death and survival[J];Chinese Journal of Cancer;2013年12期

9 林松;范磊;邵增務(wù);;微RNA調(diào)控自噬研究進(jìn)展[J];國(guó)際骨科學(xué)雜志;2013年05期

10 鄭溜豐;彭健;;中樞神經(jīng)系統(tǒng)整合外周信號(hào)調(diào)節(jié)采食量的分子機(jī)制[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年10期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 張克山;劉永杰;成偉偉;尚佑軍;逯忠新;劉湘濤;;羊傳染性膿皰病毒逃避宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)羊?qū)W分會(huì)2014年全國(guó)養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)議論文集[C];2014年

2 魯倩倩;陳同洋;秦鵬鈞;姜學(xué)軍;;真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物Rasfonin(A304)引起細(xì)胞死亡機(jī)理研究[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)第六屆會(huì)員代表大會(huì)（2014年學(xué)術(shù)年會(huì)）暨貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇會(huì)議摘要[C];2014年

3 薛玉;劉毅;張旭霞;ZHANG Jun-jie;李傳友;;結(jié)核病與Parkin蛋白[A];科學(xué)研究與結(jié)核病防治高峰論壇論文匯編[C];2014年

4 孟韜;馬蘭萍;于霆;王昕;余科;沈競(jìng)康;;mTOR激酶抑制劑SCC-31的臨床前研究[A];第十二屆全國(guó)青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會(huì)論文集[C];2014年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 郭良興;吉林省羊傳染性膿皰病流行病學(xué)調(diào)g捌涿鴰鉅咼緄難兄芠D];吉林大學(xué);2012年

2 張力;單組分納米材料在癌癥診斷和細(xì)胞自噬介導(dǎo)的癌癥治療中的應(yīng)用研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

3 鄭慧芬;自噬在系統(tǒng)性炎癥所致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷中的作用及機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2013年

4 楊愛(ài)民;Neuronostatin對(duì)痛覺(jué)、胃腸運(yùn)動(dòng)和情緒的影響及脂基化蛋白LC3-Ⅱ的半合成[D];蘭州大學(xué);2013年

5 黃星;凋亡抑制蛋白XIAP抑制自噬促進(jìn)腫瘤形成的作用機(jī)制研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

6 王振波;LC3A在食管鱗癌中的放化療敏感性預(yù)測(cè)作用[D];山東大學(xué);2013年

7 劉峗;調(diào)控鑷鈷基納米材料及納米基因載體的自噬效應(yīng)在腫瘤診療中的應(yīng)用[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

8 成娟;自噬在白血病K562/ADM細(xì)胞多藥耐藥性及三氧化二砷抗白血病效應(yīng)中的作用[D];蘭州大學(xué);2013年

9 沈薇;卵巢衰老相關(guān)基因的功能驗(yàn)證和機(jī)制探討[D];華中科技大學(xué);2013年

10 高麗;血管緊張素-（1-7）在高血壓及腦缺血損傷中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張海瑞;羊口瘡病毒的分離鑒定及其ELISA檢測(cè)方法的建立[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

2 羅云;羊傳染性膿皰病毒生物學(xué)特性及PCR檢測(cè)方法的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

3 王輝;羊傳染性膿皰病毒F1L基因克隆、序列分析及核酸探針的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

4 王改麗;RNAi抑制羊傳染性膿皰病毒增殖效果的研究[D];吉林大學(xué);2012年

5 張紹進(jìn);泛素激活酶Ubal對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)機(jī)理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 魏芳;ApoG2對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射增敏作用及與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

7 蘇高莉;羊傳染性膿皰病毒農(nóng)安株的分離鑒定及其免疫原蛋白的表達(dá)與純化[D];吉林大學(xué);2013年

8 齊赫;二甲雙胍對(duì)貢氏假鰓溕壽命、行為學(xué)、代謝及組織學(xué)衰老指標(biāo)的影響[D];山東師范大學(xué);2013年

9 尚斌;抑制自噬對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)靜脈血栓機(jī)化再通的影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2013年

10 陳露;基質(zhì)細(xì)胞Cav-1表達(dá)影響骨髓瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性[D];蘇州大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：ORFV感染宿主細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜變化及其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：501079