發(fā)布時(shí)間：2017-06-24 03:03

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄分析煙粉虱應(yīng)對(duì)寄主轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制及唾液效應(yīng)因子BtQ56在其中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：煙粉虱Bemisia tabaci是一個(gè)物種復(fù)合體,至少包含34個(gè)外部形態(tài)難以區(qū)分但相互之間存在生殖隔離的隱種。其中,Middle East Asia Minor1(MEAM1)和Mediterranean (MED)煙粉虱是世界范圍的入侵害蟲,己入侵到包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)并逐漸取代許多土著煙粉虱,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn),入侵煙粉虱MEAM1比土著煙粉虱Asia Ⅱ3具有更廣泛的寄主范圍,這可能是其能夠入侵和取代土著煙粉虱的重要原因之一。在自然環(huán)境中,煙粉虱的擴(kuò)散和繁衍需要應(yīng)對(duì)和利用不同的寄主植物,因此明確不同隱種煙粉虱在寄主適應(yīng)能力上的差異及寄主適應(yīng)性的分子機(jī)制,對(duì)深入了解煙粉虱的入侵機(jī)制和煙粉虱-植物互作的復(fù)雜關(guān)系有著重要的意義。 本論文首先比較了入侵煙粉虱MEAM1和土著煙粉虱Asia Ⅱ3從其適宜寄主棉花上轉(zhuǎn)移到不適寄主煙草上后死亡率和產(chǎn)卵量的差異。然后通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)分析了寄主轉(zhuǎn)換后,兩個(gè)隱種煙粉虱在基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異。最后結(jié)合煙粉虱唾液腺轉(zhuǎn)錄組,篩選與煙粉虱寄主適應(yīng)性相關(guān)的唾液效應(yīng)因子蛋白并研究其功能。研究結(jié)果如下： (1) MEAM1煙粉虱具有更強(qiáng)的適應(yīng)寄主轉(zhuǎn)換的能力 當(dāng)MEAM1和Asia Ⅱ3煙粉虱從棉花上轉(zhuǎn)移到煙草上24h后,其死亡率和繁殖力都發(fā)生顯著變化,但MEAM1的死亡率顯著低于AsiaⅡ3煙粉虱,而MEAM1的單頭產(chǎn)卵量則要顯著高于Asia Ⅱ3,這說(shuō)明與Asia Ⅱ3煙粉虱相比MEAM1煙粉虱具有更強(qiáng)的適應(yīng)非適宜寄主的能力。 (2)寄主轉(zhuǎn)移后NIE AM1和Asia Ⅱ3煙粉虱的基因轉(zhuǎn)錄差異 通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜分析了NIE AMI和Asia Ⅱ3煙粉虱寄主轉(zhuǎn)換前后的基因表達(dá)的不同,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)隱種煙粉虱的基因轉(zhuǎn)錄存在巨大差異,MEAM1煙粉虱的差異表達(dá)基因數(shù)量遠(yuǎn)小與AsiaⅡ3。AsiaⅡ3煙粉虱的差異表達(dá)基因的變化倍數(shù)更大且以下調(diào)為主,而MEAM1的差異表達(dá)基因的變化倍數(shù)較小且多為上調(diào)。寄主轉(zhuǎn)換后,Asia Ⅱ3煙粉虱的碳水化合物及能量代謝途徑受到了顯著的抑制,而MEAM1煙粉虱則受影響不大。此外,MEAM1煙粉虱的基因表達(dá)和蛋白代謝途徑在寄主轉(zhuǎn)換后被激活。相對(duì)于解毒酶基因在MEA M1煙粉虱中的持續(xù)高表達(dá),絕大多數(shù)的解毒酶基因在Asia Ⅱ3中下調(diào)。P450、GST和酯酶的酶活力測(cè)定進(jìn)一步證明了MEAM1煙粉虱的解毒代謝能力比AsiaⅡ3煙粉虱強(qiáng)。 (3)唾液蛋白BtQ56在寄主轉(zhuǎn)換中的作用 結(jié)合表達(dá)譜和唾液腺轉(zhuǎn)錄組信息,我們篩選了68個(gè)可能與寄主適應(yīng)性相關(guān)的疑似唾液蛋白基因,通過(guò)RNAi和植物瞬時(shí)表達(dá)等方法發(fā)現(xiàn)一個(gè)唾液蛋白BtQ56具有促進(jìn)煙粉虱存活和產(chǎn)卵的功能。BtQ56基因是一個(gè)在煙粉虱唾液腺中特異性高表達(dá)的功能未知基因,氨基酸序列含有信號(hào)肽且不含跨膜區(qū),具有典型的分泌蛋白結(jié)構(gòu),且未在GeneBank中檢索到任何同源基因或保守的功能結(jié)構(gòu)域。BtQ56基因在入侵煙粉虱MEAM1和MED中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于土著Asia Ⅱ3煙粉虱。在寄主轉(zhuǎn)換后BtQ56基因在NE AMI和MED煙粉虱中顯著上調(diào),而Asia Ⅱ3煙粉虱中變化不大,這表明大量的BtQ56可能在寄主轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)Western blot的方法,我們?cè)跓煼凼∈尺^(guò)的植物中檢測(cè)到了BtQ56蛋白,從而證明BtQ56是一個(gè)煙粉虱唾液分泌蛋白。為進(jìn)一步明確BtQ56是如何增強(qiáng)煙粉虱寄主適應(yīng)性的,我們分析了BtQ56作用于植物后對(duì)植物防御反應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響,發(fā)現(xiàn)BtQ56可能誘導(dǎo)SA途徑并抑制JA途徑及植物蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)錄,以此達(dá)到抑制植物抗性促進(jìn)煙粉虱存活的目的。 綜上所述,在煙粉虱應(yīng)對(duì)非適宜寄主的過(guò)程中,入侵煙粉虱與土著隱種煙粉虱之間在適應(yīng)能力上存在明顯差異。從棉花轉(zhuǎn)移到煙草后,碳水化合物及能量代謝和解毒代謝在Asia Ⅱ3煙粉虱中受到顯著的抑制,而在MEAM1中變化不大,說(shuō)明MEAM1在這些方面具有較強(qiáng)的耐受能力�；虮磉_(dá)和蛋白代謝途徑在MEAM1煙粉虱中的激活可能是MEAM1具有較強(qiáng)寄主轉(zhuǎn)換適應(yīng)能力的重要原因。除此之外,唾液效應(yīng)蛋白BtQ56在煙粉虱應(yīng)對(duì)煙草防御反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：煙粉虱 寄主轉(zhuǎn)換 表達(dá)譜 唾液腺 唾液蛋白 瞬時(shí)表達(dá) 基因沉默 害蟲誘導(dǎo)的防御反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S433
【目錄】：

• 致謝6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-15
• 1 文獻(xiàn)綜述及研究目的15-32
• 1.1 煙粉虱概述15-21
• 1.1.1 煙粉虱的生物學(xué)特性、分類和種系發(fā)生狀況15-16
• 1.1.2 煙粉虱的經(jīng)濟(jì)重要性及危害方式16-18
• 1.1.3 煙粉虱的入侵和競(jìng)爭(zhēng)取代的機(jī)制18-21
• 1.2 煙粉虱適應(yīng)不同寄主植物的機(jī)制21-23
• 1.2.1 取食行為與營(yíng)養(yǎng)代謝21-22
• 1.2.2 生理機(jī)制22-23
• 1.3 唾液在調(diào)控植物與昆蟲互作中的作用23-30
• 1.3.1 煙粉虱的唾液腺(salivary glands)23-24
• 1.3.2 唾液的組成及作用24-28
• 1.3.3 刺吸式昆蟲唾液蛋白的研究方法28-30
• 1.4 本研究目的與主要內(nèi)容30-32
• 1.4.1 研究目的30-31
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容31-32
• 2 基本材料和方法32-41
• 2.1 基本材料32-35
• 2.1.1 供試?yán)ハx及其實(shí)驗(yàn)種群維持32
• 2.1.2 供試植物32
• 2.1.3 生態(tài)學(xué)研究主要儀器和設(shè)備32-34
• 2.1.4 生化及分子生物學(xué)研究主要儀器和設(shè)備34
• 2.1.5 主要分子生物學(xué)試劑34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 2.2.1 煙粉虱基因組DNA的提取35
• 2.2.2 煙粉虱隱種鑒定35-37
• 2.2.3 Total RNA的提取37-38
• 2.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄合成1鏈cDNA38
• 2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)38-39
• 2.2.6 SDS-PAGE39
• 2.2.7 蛋白印跡Western blot39-40
• 2.2.8 煙粉虱臨時(shí)種群的建立及初羽化雌雄蟲的獲得40
• 2.3 數(shù)據(jù)處理與分析40-41
• 3 不同隱種煙粉虱寄主轉(zhuǎn)換的表達(dá)譜分析41-62
• 3.1 材料與方法41-45
• 3.1.1 供試?yán)ハx與植物41
• 3.1.2 寄主轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)41
• 3.1.3 RNA提取,DGE文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序41-42
• 3.1.4 標(biāo)簽注釋及基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化42
• 3.1.5 差異基因表達(dá)分析42-43
• 3.1.6 GO及KEGG pathway富集分析43
• 3.1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析驗(yàn)證表達(dá)譜數(shù)據(jù)43
• 3.1.8 解毒酶活性測(cè)定43-45
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析45-59
• 3.2.1 寄主轉(zhuǎn)移后煙粉虱的死亡率和產(chǎn)卵量45-46
• 3.2.2 寄主轉(zhuǎn)移后MEAM1和AsiaⅡ3煙粉虱的基因表達(dá)差異46-48
• 3.2.3 GO及KEGG pathway分析48-52
• 3.2.4 寄主轉(zhuǎn)換抑制AsiaⅡ3煙粉虱的碳水化合物及能量代謝52-54
• 3.2.5 寄主轉(zhuǎn)換后MEAM1煙粉虱的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)代謝變化54-55
• 3.2.6 MEAM1和AsiaⅡ3煙粉虱在解毒酶基因表達(dá)調(diào)控方面的差異55-57
• 3.2.7 MEAM1和AsiaⅡ3煙粉虱寄主轉(zhuǎn)換后解毒酶活性的變化57-59
• 3.3 小結(jié)與討論59-62
• 4 煙粉虱唾液效應(yīng)因子BTQ56在寄主轉(zhuǎn)換中的作用62-89
• 4.1 材料與方法62-71
• 4.1.1 供試?yán)ハx與植物62-63
• 4.1.2 煙粉虱疑似唾液效應(yīng)因子BtQ56基因的克隆和與序列分析63-64
• 4.1.3 熒光定量PCR檢測(cè)BtQ56基因在各組織和發(fā)育階段的表達(dá)64
• 4.1.4 熒光定量PCR檢測(cè)BtQ56基因在寄主轉(zhuǎn)換后的差異表達(dá)64
• 4.1.5 原核表達(dá)及多抗制備64-65
• 4.1.6 免疫熒光檢測(cè)BtQ56在煙粉虱各組織的表達(dá)65-66
• 4.1.7 唾液分泌蛋白驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)66
• 4.1.8 雙鏈RNA(dsRNA)的合成66
• 4.1.9 飼喂法沉默BtQ56基因及沉默效果驗(yàn)證66-67
• 4.1.10 RANi后煙粉虱生物測(cè)定67
• 4.1.11 瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證67-70
• 4.1.12 煙粉虱在瞬時(shí)表達(dá)BtQ56基因煙草上的存活率和單雌產(chǎn)卵量70
• 4.1.13 BtQ56基因?qū)煵莘烙虻恼{(diào)控70-71
• 4.1.14 數(shù)據(jù)分析71
• 4.2 結(jié)果與分析71-85
• 4.2.1 BtQ56基因的克隆與序列分析71-74
• 4.2.2 BtQ56基因在煙粉虱在發(fā)育階段的表達(dá)模式74-75
• 4.2.3 BtQ56基因在煙粉虱不同隱種和寄主轉(zhuǎn)換后的表達(dá)差異75-76
• 4.2.4 BtQ56的原核表達(dá)和多克隆抗體制備76-77
• 4.2.5 BtQ56在煙粉虱組織中的分布77-78
• 4.2.6 Western blot驗(yàn)證BtQ56為煙粉虱唾液分泌蛋白78-79
• 4.2.7 飼喂dsRNA對(duì)煙粉虱BtQ56基因表達(dá)水平的影響79-80
• 4.2.8 RNAi干擾BtQ56基因?qū)煼凼婊盥实挠绊?/span>80-81
• 4.2.9 EGFP基因在煙草和棉花中的瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證81-82
• 4.2.10 BtQ56基因在植物中瞬時(shí)表達(dá)促進(jìn)煙粉虱的存活和產(chǎn)卵82
• 4.2.11 瞬時(shí)表達(dá)BtQ56基因?qū)煵莘烙嚓P(guān)基因的影響82-85
• 4.3 小結(jié)與討論85-89
• 5 全文總結(jié)89-91
• 5.1 全文小結(jié)89-90
• 5.2 創(chuàng)新之處90
• 5.3 值得繼續(xù)研究的問(wèn)題90-91
• 參考文獻(xiàn)91-102
• 附錄102-109

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄分析煙粉虱應(yīng)對(duì)寄主轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制及唾液效應(yīng)因子BtQ56在其中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：476918