本文關(guān)鍵詞：稻瘟病菌DNA結(jié)合蛋白Pcg2和MoSub1 DNA結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是引起水稻稻瘟病的病原,被評選為十大植物病原真菌之首。由于水稻在世界糧食安全上的重要地位以及稻瘟菌的一些獨(dú)特的生物學(xué)特性,稻瘟病菌己成為研究真菌特別是絲狀真菌與植物相互作用的模式生物。因此,了解稻瘟菌的致病分子機(jī)理不僅有利于稻瘟病的防治,對其它病原真菌的研究也具有指導(dǎo)意義。DNA結(jié)合蛋白是生物體內(nèi)一類非常重要的蛋白,參與調(diào)控DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)、重排等眾多生化進(jìn)程,從而影響生長發(fā)育進(jìn)程以及病原菌的致病侵染過程等。本研究通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段對稻瘟菌中兩個(gè)DNA結(jié)合蛋白Pcg2和MoSubl的DNA結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了研究。前期研究表明Pcg2是稻瘟菌中的一個(gè)APSES類轉(zhuǎn)錄因子,能夠結(jié)合順式作用元件MCB和SCB,并在稻瘟病菌的致病過程中發(fā)揮重要的作用。稻瘟病菌卻cg2缺失突變體幾乎喪失對水稻的致病性,而其DNA結(jié)合活性是其發(fā)揮功能所必需的。作者通過分析型超速離心技術(shù)分析了溶液中Pcg2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Pcg2-DBD)與MCB形成復(fù)合物的情況。結(jié)果表明Pcg2-DBD與MCB可以形成兩種不同的復(fù)合物：在低濃度下蛋白分子與核酸分子形成以1：1比例為主的復(fù)合物,而高濃度下則是以2：1比例形成的復(fù)合物為主。而且重組表達(dá)的含Pcg2-DBD和ANK區(qū)域的截?cái)囿wPcg21-424以二聚體形式存在。這些結(jié)果表明Pcg2在體內(nèi)可能是以二體形式結(jié)合DNA的。由于Pcg21-424非常易于降解,作者基于已經(jīng)解析的Pcg2 DBD與MCB復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)了一個(gè)二體突變體Pcg2 DBD Q82C,制備了其與SCB以及UN1、BT1等的DNA復(fù)合物,并進(jìn)行了晶體生長條件的篩選。目前已經(jīng)解析了突變體母體的結(jié)構(gòu),正在分析未獲得DNA復(fù)合物晶體的原因并繼續(xù)進(jìn)行復(fù)合物晶體生長條件的篩選。此外,作者通過SPR技術(shù)對模擬磷酸化突變體S123E研究發(fā)現(xiàn),S123位磷酸化對于單獨(dú)的Pcg2-DBD與MCB和SCB的結(jié)合可能并沒有明顯的影響。遺傳分析表明MoSub1可能是氮源缺乏時(shí)稻瘟病菌菌絲生長的負(fù)調(diào)控子.MoSub1是人源PC4和酵母Subl在稻瘟菌中的同源蛋白,它們都擁有高度保守的ssDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,但是其序列及功能又存在著差異,而且這些差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)尚未見報(bào)道。PC4中F77位和W89位是參與結(jié)合ssDNA的關(guān)鍵位點(diǎn)。作者分析發(fā)現(xiàn)F77在所有的PC4同源物中都是保守的,但W89在包括稻瘟菌MoSub1在內(nèi)的7個(gè)物種的PC4同源物中被酪氨酸Y替換。作者解析了PC4 W89Y突變體與19T1G ssDNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu),并將其與稻瘟菌MoSub1-19T1G復(fù)合物以及PC4-19T1G復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)原本存在于PC4W89位附近的一疏水口袋在等價(jià)的MoSub1 Y74位和PC4突變體中的Y89位附近消失了。研究結(jié)果表明MoSub1中保守的Y74殘基或PC4中W89殘基不僅在其與DNA特異性相互作用中起著重要作用,也決定了PC4類ssDNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合模式。而DNA結(jié)合模式差異與其功能關(guān)系有待進(jìn)一步研究加以確認(rèn)。此外,作者利用磷酸化模擬突變體和CKII激酶磷酸化樣品研究了磷酸化作用對MoSub1的DNA結(jié)合活性的影響。結(jié)果表明,與PC4和Subl不同,磷酸化作用對MoSub1與ssDNA的親和力并沒有明顯的影響。同時(shí),作者還發(fā)現(xiàn)磷酸根離子可能影響MoSub1-ssDNA復(fù)合物的形成,相關(guān)研究正在進(jìn)行中。上述這些研究對我們深入理解稻瘟菌中DNA結(jié)合蛋白Pcg 2和MoSub1與DNA相互作用的分子細(xì)節(jié)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),也為我們?nèi)娼沂舅鼈冊诓≡婢L發(fā)育和致病過程的生物學(xué)功能提供了結(jié)構(gòu)線索。
【關(guān)鍵詞】：稻瘟病菌 晶體結(jié)構(gòu) DNA結(jié)合蛋白 Pcg2 MoSub1
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.41
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略語表9-10
• 第一章 緒論10-45
• 1.1 引言10-11
• 1.2 DNA結(jié)合蛋白在稻瘟菌生長發(fā)育和致病性中的作用11-19
• 1.3 APSES類轉(zhuǎn)錄因子的研究19-29
• 1.4 PC4類DNA結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展29-38
• 1.5 結(jié)構(gòu)生物方法簡介38-44
• 1.6 本研究的研究內(nèi)容及意義44-45
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法45-62
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料45-49
• 2.2 常用溶液及培養(yǎng)基的配制49-52
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法52-62
• 第三章 Pcg2 DBD聚集狀態(tài)及磷酸化作用對其DNA結(jié)合活性影響的分析62-75
• 3.1 Pcg2~(1-138)-MCB DNA復(fù)合物溶液狀態(tài)的分析62-63
• 3.2 Pcg2~(1-138)Q82C突變體DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)63-70
• 3.3 Pcg2~(1-138)S123E模擬磷酸化突變體DNA結(jié)合活性的研究70-73
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與討論73-75
• 第四章 殘基Y74、磷酸化作用及磷酸根離子對MoSub1 ssDNA結(jié)合活性的影響75-102
• 4.1 MoSub1與PC4 DNA結(jié)合模式區(qū)別的研究75-85
• 4.2 磷酸化作用對MoSub1 DNA結(jié)合活性的影響85-92
• 4.3 磷酸根離子對MoSub1 DNA結(jié)合活性的影響92-96
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與討論96-102
• 第五章 總結(jié)與展望102-103
• 參考文獻(xiàn)103-118
• 致謝118-120
• 附錄120-122
• 作者簡歷122

  本文關(guān)鍵詞：稻瘟病菌DNA結(jié)合蛋白Pcg2和MoSub1 DNA結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：463591