本文關鍵詞：稻曲病菌基因敲除體系的建立及HOG1基因在稻曲病菌和禾谷鐮刀菌中功能驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻稻曲病是由病原真菌Ustilaginoidea virens引起的一種水稻穗部病害。該病害目前在世界范圍流行,并已經成為我國水稻生產的主要病害,不僅導致了水稻產量的損失,而且會合成對人畜和植物有害的稻曲菌素,危害糧食安全�，F(xiàn)階段對該病害的研究尚處于起步階段,對其生活史、侵染類型等基本問題尚未完全明確。目前針對稻曲病菌基因功能的研究主要通過病原菌表達譜分析,或是通過對隨機插入突變體庫進行性狀篩選進行,尚沒有針對該病原菌基因敲除體系的報道。由于基因敲除突變體的獲得是基因功能鑒定的基礎,該體系的缺失嚴重制約了稻曲病菌基因功能的研究。本試驗通過分析和比較絲狀真菌中常用的遺傳轉化方法,選取了根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系(ATMT)以及PEG介導的原生質體轉化方法對稻曲病菌的基因敲除進行嘗試,并在ATMT體系基礎上成功的對稻曲病菌HOG1基因進行了敲除。試驗首先對雙元轉化載體p CAMBIA1300進行了改造,獲得了稻曲病菌基因敲除的載體p CBDW以及回復突變載體p CBDW-GEN,并在此基礎上構建了Uv HOG1基因的敲除載體和回復突變載體。隨后通過對ATMT體系進行改進和調整,建立了稻曲病菌的基因敲除體系,并在617個轉化子中成功篩選到了Uvhog1突變體。試驗利用所建立的敲除體系進一步對5個非核糖體肽NRPS基因進行敲除試驗,結果表明該基因敲除體系可以應用于稻曲菌一般基因的敲除,其同源重組概率為1.67%。在基因功能鑒定方面,試驗所獲得的Uvhog1突變體在營養(yǎng)生長過程表現(xiàn)生長速度的減慢,菌絲間分支角度減小,色素的合成受到抑制;雖然分生孢子及萌發(fā)的形態(tài)均未受到影響,但產孢量明顯的下降。Uv HOG1基因的缺失不僅導致了突變體對滲透壓敏感程度的升高,還導致了Uvhog1突變體無法通過山梨醇和甘油等相容性物質的積累對細胞內外滲透壓進行平衡,同時,與氧化壓力相關的轉錄因子Uv ATF1和Uv SKN7也由于Uv HOG1的缺失而無法正常表達。此外,Uvhog1突變體對細胞膜壓力表現(xiàn)出很高的敏感性,而在細胞壁的壓力下沒有明顯的表型。在水稻種子萌發(fā)過程中,Uvhog1突變體培養(yǎng)物的濾液對水稻幼苗生長的抑制作用有所減弱。與稻曲病相比,小麥赤霉病主要是由Fusarium graminearum引起的一種小麥病害。該病害在全世界范圍內的發(fā)生逐漸趨于頻繁,在影響小麥產量的同時,還會產生DON等毒素,降低谷物品質并造成食品安全問題。為了更為全面的驗證HOG1基因在不同病原真菌中的功能,實驗對F.graminearum中HOG1信號通路的同源基因Fg SSK2,Fg PBS2以及Fg HOG1分別進行了敲除和功能驗證。該信號通路中任一基因的缺失導致了突變體生長速度的減慢以及分生孢子產量的下降;突變體在對滲透壓敏感度提高的同時,也部分喪失了通過積累甘油、甘露醇、阿拉伯醇以及蔗糖平衡細胞內外滲透壓的能力;此外,各突變體還表現(xiàn)出了對氧化壓力、細胞膜壓力敏感度的提高,以及對細胞壁壓力的耐受性。Fg HOG1通路的突變體還喪失了有性生殖過程中的雌性生殖能力,并且各突變體的致病力及DON毒素的合成能力均有明顯下降。本試驗首次建立了針對稻曲病菌的基因敲除體系,并成功獲得了Uvhog1突變體,為稻曲病菌基因組功能分析提供了方法上強有力的支持。另一方面,通過分析和比較F.graminearum和U.virens中HOG1基因的功能,更為全面的驗證了該基因在營養(yǎng)生長、分生孢子的產生、壓力應答、細胞完整性、有性生殖以及致病力和毒性方面的保守性及差異性,也為水稻稻曲病和小麥赤霉病的防控提供了一定的理論依據。
【關鍵詞】：稻曲病 基因敲除 HOG1 小麥赤霉病
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第1章 文獻綜述15-30
• 1.1 水稻稻曲病概述及研究現(xiàn)狀15-20
• 1.1.1 稻曲病菌的分類學地位15-16
• 1.1.2 病害特征和侵染循環(huán)16-17
• 1.1.3 水稻稻曲病的流行學特征17-18
• 1.1.4 稻曲病菌的分離、培養(yǎng)及人工接種體系18
• 1.1.5 稻曲菌素的毒性及合成18
• 1.1.6 稻曲病的防治18-19
• 1.1.7 稻曲病的分子遺傳學研究19-20
• 1.2 小麥赤霉病概述及研究現(xiàn)狀20-23
• 1.2.1 小麥赤霉病病害循環(huán)21-22
• 1.2.2 小麥赤霉病的防治22
• 1.2.3 F. graminearum交配型22
• 1.2.4 DON的合成22
• 1.2.5 F. graminearum的分子生物學研究22-23
• 1.3 蛋白磷酸化激酶信號通路23-24
• 1.3.1 酵母中的MAPK信號通路23-24
• 1.3.2 絲狀真菌中的HOG1信號通路24
• 1.4 絲狀真菌遺傳轉化體系24-27
• 1.4.1 Li Ac轉化體系25
• 1.4.2 REMI轉化體系25
• 1.4.3 電激轉化25
• 1.4.4 基因槍25-26
• 1.4.5 PEG介導的原生質體轉化26
• 1.4.6 根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系26-27
• 1.4.7 稻曲病菌的遺傳轉化體系27
• 1.5 本課題的立題依據、研究目的及內容27-30
• 1.5.1 課題的立題依據、目的和創(chuàng)新點27-28
• 1.5.2 課題內容28-29
• 1.5.3 課題研究的技術路線29-30
• 第2章 稻曲病菌基因敲除體系的建立30-45
• 2.1 材料與方法30-39
• 2.1.1 材料30-32
• 2.1.1.1 質粒30
• 2.1.1.2 菌株30-31
• 2.1.1.3 主要培養(yǎng)基成分31
• 2.1.1.4 主要試劑及服務31
• 2.1.1.5 主要儀器31-32
• 2.1.1.6 軟件及數(shù)據庫32
• 2.1.2 方法32-39
• 2.1.2.1 pCAMBIA1300質粒改造32-33
• 2.1.2.2 UvHOG1敲除載體的獲得33-35
• 2.1.2.3 質粒pCBDW GEN的構建35
• 2.1.2.4 UvHOG1回復突變載體及農桿菌菌株的獲得35-36
• 2.1.2.5 稻曲病菌UvHOG1基因敲除體系的建立36-37
• 2.1.2.6 轉化子DNA的小量快速提取37
• 2.1.2.7 轉化子DNA的PCR檢測37-38
• 2.1.2.8 轉化子的Southern雜交驗證38-39
• 2.1.2.9 Uvhog1突變體的回復突變39
• 2.2 結果39-43
• 2.2.1 UvHOG1敲除載體及功能互補載體的獲得39-40
• 2.2.2 轉化子的PCR檢測結果40-42
• 2.2.3 轉化子UVHG653的southern雜交驗證結果42
• 2.2.4 回復突變體菌株的獲得42-43
• 2.3 小結43-45
• 第3章 UvHOG1基因的功能鑒定45-59
• 3.1 材料與方法45-48
• 3.1.1 材料45-46
• 3.1.1.1 水稻種子45
• 3.1.1.2 主要培養(yǎng)基成分45
• 3.1.1.3 主要試劑45
• 3.1.1.4 主要儀器45-46
• 3.1.2 方法46-48
• 3.1.2.1 在不同培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)46
• 3.1.2.2 菌落邊緣的觀察46
• 3.1.2.3 分生孢子的收集和萌發(fā)46
• 3.1.2.4 各種壓力篩選的濃度46-47
• 3.1.2.5 RNA提取、純化、反轉及實時熒光定量PCR檢測47
• 3.1.2.6 相容性代謝產物的檢測47-48
• 3.1.2.7 突變體對水稻萌發(fā)的抑制作用48
• 3.2 實驗結果48-57
• 3.2.1 Uvhog1突變體的營養(yǎng)生長，分生孢子產生以及色素的形成48-52
• 3.2.2 Uvhog1突變體在不同壓力篩選下的表型52-53
• 3.2.3 Uvhog1基因的敲除對UvATF1、UvSKN7和UvAP1基因表達水平的影響53-54
• 3.2.4 Uvhog1突變體在滲透壓條件下甘油和山梨醇的積累54
• 3.2.5 Uvhog1突變體培養(yǎng)液對水稻種子萌發(fā)的影響54-56
• 3.2.6 Uvhog1突變體內uv_ustA基因的表達情況56-57
• 3.3 小結57-59
• 第4章 小麥赤霉病菌中FgHOG1信號通路的功能鑒定59-78
• 4.1 材料與方法59-63
• 4.1.1 材料59-60
• 4.1.1.1 菌株59
• 4.1.1.2 主要培養(yǎng)基成分59-60
• 4.1.1.3 主要試劑60
• 4.1.1.4 主要儀器60
• 4.1.2 方法60-63
• 4.1.2.1 突變體的獲得及驗證60-61
• 4.1.2.2 Fghog1回復突變體的獲得及亞細胞定位61
• 4.1.2.3 菌株在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)61
• 4.1.2.4 分生孢子的收集和萌發(fā)61
• 4.1.2.5 菌落表面疏水性的測試61
• 4.1.2.6 菌落邊緣觀察61-62
• 4.1.2.7 各種壓力篩選的濃度62
• 4.1.2.8 相容性代謝產物的測定62
• 4.1.2.9 有性生殖62
• 4.1.2.10 致病力的檢測62-63
• 4.1.2.11 侵染過程的半薄切片觀察63
• 4.1.2.12 DAPI染色63
• 4.2 結果63-76
• 4.2.1 Fgssk2、Fgpbs2和Fghog1突變體的獲得及Southern雜交驗證63-64
• 4.2.2 FgHOG1信號通路對F. graminearum營養(yǎng)生長的影響64-67
• 4.2.3 FgHOG1信號通路在不同壓力篩選下的營養(yǎng)生長67-70
• 4.2.4 Fghog1突變體在滲透壓條件下細胞內相容性物質的積累70
• 4.2.5 Fghog1突變體的有性生殖能力70-72
• 4.2.6 FgHOG1信號通路對于致病力的重要性72-75
• 4.2.7 FgHOG1基因的亞細胞定位75-76
• 4.3 小結76-78
• 第5章 討論78-88
• 5.1 雙元轉化載體的改造過程78-79
• 5.2 稻曲病菌不同轉化方法之間的比較79-82
• 5.2.1 通過ATMT體系對UvHOG1基因進行敲除的同源重組概率80
• 5.2.2 ATMT體系在稻曲病菌基因敲除過程中的一般效率80-81
• 5.2.3 PEG介導的原生質體遺傳轉化體系81-82
• 5.2.4 電激轉化82
• 5.3 U. virens和F. graminearum中HOG1同源基因功能的分析與比較82-88
• 5.3.1 UvHOG1的進化樹分析82-84
• 5.3.2 HOG1對U. virens和F. graminearum營養(yǎng)生長的調控84
• 5.3.3 HOG1在滲透壓調節(jié)過程中的作用84-85
• 5.3.4 HOG1在其他壓力脅迫下的表型85
• 5.3.5 HOG1與壓力脅迫相關轉錄因子間的關系85-86
• 5.3.6 HOG1的缺失對突變體致病力的影響86-88
• 第6章 總結與展望88-90
• 參考文獻90-104
• 附表 本文所使用引物序列104-107
• 英文縮寫表107-109
• 致謝109-111
• 作者簡介111

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前5條

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  本文關鍵詞：稻曲病菌基因敲除體系的建立及HOG1基因在稻曲病菌和禾谷鐮刀菌中功能驗證，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：439564