本文關(guān)鍵詞：稻曲病菌基因敲除體系的建立及HOG1基因在稻曲病菌和禾谷鐮刀菌中功能驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻稻曲病是由病原真菌Ustilaginoidea virens引起的一種水稻穗部病害。該病害目前在世界范圍流行,并已經(jīng)成為我國水稻生產(chǎn)的主要病害,不僅導(dǎo)致了水稻產(chǎn)量的損失,而且會(huì)合成對(duì)人畜和植物有害的稻曲菌素,危害糧食安全。現(xiàn)階段對(duì)該病害的研究尚處于起步階段,對(duì)其生活史、侵染類型等基本問題尚未完全明確。目前針對(duì)稻曲病菌基因功能的研究主要通過病原菌表達(dá)譜分析,或是通過對(duì)隨機(jī)插入突變體庫進(jìn)行性狀篩選進(jìn)行,尚沒有針對(duì)該病原菌基因敲除體系的報(bào)道。由于基因敲除突變體的獲得是基因功能鑒定的基礎(chǔ),該體系的缺失嚴(yán)重制約了稻曲病菌基因功能的研究。本試驗(yàn)通過分析和比較絲狀真菌中常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法,選取了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系(ATMT)以及PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法對(duì)稻曲病菌的基因敲除進(jìn)行嘗試,并在ATMT體系基礎(chǔ)上成功的對(duì)稻曲病菌HOG1基因進(jìn)行了敲除。試驗(yàn)首先對(duì)雙元轉(zhuǎn)化載體p CAMBIA1300進(jìn)行了改造,獲得了稻曲病菌基因敲除的載體p CBDW以及回復(fù)突變載體p CBDW-GEN,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了Uv HOG1基因的敲除載體和回復(fù)突變載體。隨后通過對(duì)ATMT體系進(jìn)行改進(jìn)和調(diào)整,建立了稻曲病菌的基因敲除體系,并在617個(gè)轉(zhuǎn)化子中成功篩選到了Uvhog1突變體。試驗(yàn)利用所建立的敲除體系進(jìn)一步對(duì)5個(gè)非核糖體肽NRPS基因進(jìn)行敲除試驗(yàn),結(jié)果表明該基因敲除體系可以應(yīng)用于稻曲菌一般基因的敲除,其同源重組概率為1.67%。在基因功能鑒定方面,試驗(yàn)所獲得的Uvhog1突變體在營養(yǎng)生長過程表現(xiàn)生長速度的減慢,菌絲間分支角度減小,色素的合成受到抑制;雖然分生孢子及萌發(fā)的形態(tài)均未受到影響,但產(chǎn)孢量明顯的下降。Uv HOG1基因的缺失不僅導(dǎo)致了突變體對(duì)滲透壓敏感程度的升高,還導(dǎo)致了Uvhog1突變體無法通過山梨醇和甘油等相容性物質(zhì)的積累對(duì)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓進(jìn)行平衡,同時(shí),與氧化壓力相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Uv ATF1和Uv SKN7也由于Uv HOG1的缺失而無法正常表達(dá)。此外,Uvhog1突變體對(duì)細(xì)胞膜壓力表現(xiàn)出很高的敏感性,而在細(xì)胞壁的壓力下沒有明顯的表型。在水稻種子萌發(fā)過程中,Uvhog1突變體培養(yǎng)物的濾液對(duì)水稻幼苗生長的抑制作用有所減弱。與稻曲病相比,小麥赤霉病主要是由Fusarium graminearum引起的一種小麥病害。該病害在全世界范圍內(nèi)的發(fā)生逐漸趨于頻繁,在影響小麥產(chǎn)量的同時(shí),還會(huì)產(chǎn)生DON等毒素,降低谷物品質(zhì)并造成食品安全問題。為了更為全面的驗(yàn)證HOG1基因在不同病原真菌中的功能,實(shí)驗(yàn)對(duì)F.graminearum中HOG1信號(hào)通路的同源基因Fg SSK2,Fg PBS2以及Fg HOG1分別進(jìn)行了敲除和功能驗(yàn)證。該信號(hào)通路中任一基因的缺失導(dǎo)致了突變體生長速度的減慢以及分生孢子產(chǎn)量的下降;突變體在對(duì)滲透壓敏感度提高的同時(shí),也部分喪失了通過積累甘油、甘露醇、阿拉伯醇以及蔗糖平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的能力;此外,各突變體還表現(xiàn)出了對(duì)氧化壓力、細(xì)胞膜壓力敏感度的提高,以及對(duì)細(xì)胞壁壓力的耐受性。Fg HOG1通路的突變體還喪失了有性生殖過程中的雌性生殖能力,并且各突變體的致病力及DON毒素的合成能力均有明顯下降。本試驗(yàn)首次建立了針對(duì)稻曲病菌的基因敲除體系,并成功獲得了Uvhog1突變體,為稻曲病菌基因組功能分析提供了方法上強(qiáng)有力的支持。另一方面,通過分析和比較F.graminearum和U.virens中HOG1基因的功能,更為全面的驗(yàn)證了該基因在營養(yǎng)生長、分生孢子的產(chǎn)生、壓力應(yīng)答、細(xì)胞完整性、有性生殖以及致病力和毒性方面的保守性及差異性,也為水稻稻曲病和小麥赤霉病的防控提供了一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：稻曲病 基因敲除 HOG1 小麥赤霉病
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.111.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第1章 文獻(xiàn)綜述15-30
• 1.1 水稻稻曲病概述及研究現(xiàn)狀15-20
• 1.1.1 稻曲病菌的分類學(xué)地位15-16
• 1.1.2 病害特征和侵染循環(huán)16-17
• 1.1.3 水稻稻曲病的流行學(xué)特征17-18
• 1.1.4 稻曲病菌的分離、培養(yǎng)及人工接種體系18
• 1.1.5 稻曲菌素的毒性及合成18
• 1.1.6 稻曲病的防治18-19
• 1.1.7 稻曲病的分子遺傳學(xué)研究19-20
• 1.2 小麥赤霉病概述及研究現(xiàn)狀20-23
• 1.2.1 小麥赤霉病病害循環(huán)21-22
• 1.2.2 小麥赤霉病的防治22
• 1.2.3 F. graminearum交配型22
• 1.2.4 DON的合成22
• 1.2.5 F. graminearum的分子生物學(xué)研究22-23
• 1.3 蛋白磷酸化激酶信號(hào)通路23-24
• 1.3.1 酵母中的MAPK信號(hào)通路23-24
• 1.3.2 絲狀真菌中的HOG1信號(hào)通路24
• 1.4 絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系24-27
• 1.4.1 Li Ac轉(zhuǎn)化體系25
• 1.4.2 REMI轉(zhuǎn)化體系25
• 1.4.3 電激轉(zhuǎn)化25
• 1.4.4 基因槍25-26
• 1.4.5 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化26
• 1.4.6 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系26-27
• 1.4.7 稻曲病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系27
• 1.5 本課題的立題依據(jù)、研究目的及內(nèi)容27-30
• 1.5.1 課題的立題依據(jù)、目的和創(chuàng)新點(diǎn)27-28
• 1.5.2 課題內(nèi)容28-29
• 1.5.3 課題研究的技術(shù)路線29-30
• 第2章 稻曲病菌基因敲除體系的建立30-45
• 2.1 材料與方法30-39
• 2.1.1 材料30-32
• 2.1.1.1 質(zhì)粒30
• 2.1.1.2 菌株30-31
• 2.1.1.3 主要培養(yǎng)基成分31
• 2.1.1.4 主要試劑及服務(wù)31
• 2.1.1.5 主要儀器31-32
• 2.1.1.6 軟件及數(shù)據(jù)庫32
• 2.1.2 方法32-39
• 2.1.2.1 pCAMBIA1300質(zhì)粒改造32-33
• 2.1.2.2 UvHOG1敲除載體的獲得33-35
• 2.1.2.3 質(zhì)粒pCBDW GEN的構(gòu)建35
• 2.1.2.4 UvHOG1回復(fù)突變載體及農(nóng)桿菌菌株的獲得35-36
• 2.1.2.5 稻曲病菌UvHOG1基因敲除體系的建立36-37
• 2.1.2.6 轉(zhuǎn)化子DNA的小量快速提取37
• 2.1.2.7 轉(zhuǎn)化子DNA的PCR檢測37-38
• 2.1.2.8 轉(zhuǎn)化子的Southern雜交驗(yàn)證38-39
• 2.1.2.9 Uvhog1突變體的回復(fù)突變39
• 2.2 結(jié)果39-43
• 2.2.1 UvHOG1敲除載體及功能互補(bǔ)載體的獲得39-40
• 2.2.2 轉(zhuǎn)化子的PCR檢測結(jié)果40-42
• 2.2.3 轉(zhuǎn)化子UVHG653的southern雜交驗(yàn)證結(jié)果42
• 2.2.4 回復(fù)突變體菌株的獲得42-43
• 2.3 小結(jié)43-45
• 第3章 UvHOG1基因的功能鑒定45-59
• 3.1 材料與方法45-48
• 3.1.1 材料45-46
• 3.1.1.1 水稻種子45
• 3.1.1.2 主要培養(yǎng)基成分45
• 3.1.1.3 主要試劑45
• 3.1.1.4 主要儀器45-46
• 3.1.2 方法46-48
• 3.1.2.1 在不同培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)46
• 3.1.2.2 菌落邊緣的觀察46
• 3.1.2.3 分生孢子的收集和萌發(fā)46
• 3.1.2.4 各種壓力篩選的濃度46-47
• 3.1.2.5 RNA提取、純化、反轉(zhuǎn)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測47
• 3.1.2.6 相容性代謝產(chǎn)物的檢測47-48
• 3.1.2.7 突變體對(duì)水稻萌發(fā)的抑制作用48
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-57
• 3.2.1 Uvhog1突變體的營養(yǎng)生長，分生孢子產(chǎn)生以及色素的形成48-52
• 3.2.2 Uvhog1突變體在不同壓力篩選下的表型52-53
• 3.2.3 Uvhog1基因的敲除對(duì)UvATF1、UvSKN7和UvAP1基因表達(dá)水平的影響53-54
• 3.2.4 Uvhog1突變體在滲透壓條件下甘油和山梨醇的積累54
• 3.2.5 Uvhog1突變體培養(yǎng)液對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響54-56
• 3.2.6 Uvhog1突變體內(nèi)uv_ustA基因的表達(dá)情況56-57
• 3.3 小結(jié)57-59
• 第4章 小麥赤霉病菌中FgHOG1信號(hào)通路的功能鑒定59-78
• 4.1 材料與方法59-63
• 4.1.1 材料59-60
• 4.1.1.1 菌株59
• 4.1.1.2 主要培養(yǎng)基成分59-60
• 4.1.1.3 主要試劑60
• 4.1.1.4 主要儀器60
• 4.1.2 方法60-63
• 4.1.2.1 突變體的獲得及驗(yàn)證60-61
• 4.1.2.2 Fghog1回復(fù)突變體的獲得及亞細(xì)胞定位61
• 4.1.2.3 菌株在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)61
• 4.1.2.4 分生孢子的收集和萌發(fā)61
• 4.1.2.5 菌落表面疏水性的測試61
• 4.1.2.6 菌落邊緣觀察61-62
• 4.1.2.7 各種壓力篩選的濃度62
• 4.1.2.8 相容性代謝產(chǎn)物的測定62
• 4.1.2.9 有性生殖62
• 4.1.2.10 致病力的檢測62-63
• 4.1.2.11 侵染過程的半薄切片觀察63
• 4.1.2.12 DAPI染色63
• 4.2 結(jié)果63-76
• 4.2.1 Fgssk2、Fgpbs2和Fghog1突變體的獲得及Southern雜交驗(yàn)證63-64
• 4.2.2 FgHOG1信號(hào)通路對(duì)F. graminearum營養(yǎng)生長的影響64-67
• 4.2.3 FgHOG1信號(hào)通路在不同壓力篩選下的營養(yǎng)生長67-70
• 4.2.4 Fghog1突變體在滲透壓條件下細(xì)胞內(nèi)相容性物質(zhì)的積累70
• 4.2.5 Fghog1突變體的有性生殖能力70-72
• 4.2.6 FgHOG1信號(hào)通路對(duì)于致病力的重要性72-75
• 4.2.7 FgHOG1基因的亞細(xì)胞定位75-76
• 4.3 小結(jié)76-78
• 第5章 討論78-88
• 5.1 雙元轉(zhuǎn)化載體的改造過程78-79
• 5.2 稻曲病菌不同轉(zhuǎn)化方法之間的比較79-82
• 5.2.1 通過ATMT體系對(duì)UvHOG1基因進(jìn)行敲除的同源重組概率80
• 5.2.2 ATMT體系在稻曲病菌基因敲除過程中的一般效率80-81
• 5.2.3 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系81-82
• 5.2.4 電激轉(zhuǎn)化82
• 5.3 U. virens和F. graminearum中HOG1同源基因功能的分析與比較82-88
• 5.3.1 UvHOG1的進(jìn)化樹分析82-84
• 5.3.2 HOG1對(duì)U. virens和F. graminearum營養(yǎng)生長的調(diào)控84
• 5.3.3 HOG1在滲透壓調(diào)節(jié)過程中的作用84-85
• 5.3.4 HOG1在其他壓力脅迫下的表型85
• 5.3.5 HOG1與壓力脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子間的關(guān)系85-86
• 5.3.6 HOG1的缺失對(duì)突變體致病力的影響86-88
• 第6章 總結(jié)與展望88-90
• 參考文獻(xiàn)90-104
• 附表 本文所使用引物序列104-107
• 英文縮寫表107-109
• 致謝109-111
• 作者簡介111

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：稻曲病菌基因敲除體系的建立及HOG1基因在稻曲病菌和禾谷鐮刀菌中功能驗(yàn)證，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：439564