本文關(guān)鍵詞：長白山森林土壤纖維素酶基因多樣性分析及基因克隆與表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：尋找清潔可再生的石油替代能源是21世紀一個重要的研究發(fā)展方向。纖維素的微生物降解轉(zhuǎn)化是生產(chǎn)清潔可再生生物燃料的理想手段。篩選新的具有優(yōu)良性質(zhì)的纖維素酶具有重要的生態(tài)學意義和生產(chǎn)應用價值。天然環(huán)境,尤其是微生物資源最豐富的土壤環(huán)境是篩選纖維素酶基因的重要來源,保存完好的長白山自然保護區(qū)是一個理想的土樣樣品采集地。利用同源擴增、TAIL-PCR等分子手段,我們對長白山森林土壤纖維素酶基因的多樣性進行了研究,從中成功的篩選到了新的纖維素酶基因,并完成了異源表達和酶學性質(zhì)檢測,為纖維素酶結(jié)構(gòu)與功能的研究提供了實驗數(shù)據(jù),為人們更好的改造和利用纖維素酶提供了必要的理論依據(jù)。本文取得具體實驗結(jié)果如下:1.構(gòu)建了長白山森林土壤GH7_cbhI和GH48家族纖維素酶基因文庫,并對這兩個文庫的基因多樣性進行了研究。利用兩對簡并引物分別構(gòu)建了長白山森林土壤GH7_cbhI和GH48家族纖維素酶基因文庫,并通過大量測序及系統(tǒng)發(fā)育分析獲得了這兩個家族的基因多樣性情況。結(jié)果表明GH7_cbhI家族文庫基因多樣性較高,序列相似度在99-38%之間,95%的基因序列與來自子囊菌門和擔子菌門的非培養(yǎng)微生物基因序列相似度最高。GH48家族文庫基因序列呈現(xiàn)“單極化”現(xiàn)象,即80%以上的序列都很保守,與來自Herpetosiphon aurantiacus的內(nèi)切纖維素酶序列相似度最高。將這兩個長白山土壤基因文庫與其他報道的基因文庫進行比較發(fā)現(xiàn),長白山土壤文庫基因多樣性情況與玉米秸稈文庫相似,與海洋沉積物文庫存在差異。豐富的基因多樣性也證明了長白山森林土壤是纖維素酶開發(fā)的理想資源庫。2.利用同源擴增和TAIL-PCR等方法獲得了多條GH48和GH5家族纖維素酶基因序列,并對其序列結(jié)構(gòu)進行了分析。共克隆到2個GH48家族內(nèi)切纖維素酶基因,6個GH5家族內(nèi)切纖維素酶基因。利用同源擴增和TAIL-PCR方法,首次從天然土壤環(huán)境中克隆得到了GH48家族纖維素酶基因cel48_hm01。該基因與Herpetosiphon aurantiacus的內(nèi)切纖維素酶[WP_012187855.1]相似度最高,達62%。cel48_hm01基因蛋白序列包括一個CBM_2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個GH48催化結(jié)構(gòu)域;同時克隆了單結(jié)構(gòu)域基因cel48_hm02,其序列中僅含有一個GH48催化結(jié)構(gòu)域。利用同源引物直接擴增的方法,從土壤樣品基因組DNA中擴增得到了6個GH5家族內(nèi)切纖維素酶基因:egl01、egl02、egl03、egl04、egl05、egl06。egl01基因較egl02基因在N端缺少了17個氨基酸的序列,但兩者序列中均包含了N端催化結(jié)構(gòu)域GH5和C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM_3;兩者均與Bacillus licheniformis的內(nèi)切纖維素酶序列相似度最高,分別達99%和100%。egl03、egl04、egl05和egl06四個基因與egl02基因存在一些氨基酸位點上的差異,與bacilluslicheniformis的內(nèi)切纖維素酶序列相似度均為99%。這些基因的獲得,為研究gh5家族纖維素酶蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了理想的天然突變體。3.首次表達和純化了從土壤環(huán)境樣品中直接克隆得到的gh48家族纖維素酶,并對重組酶進行了酶學性質(zhì)檢測和同源模建。本文首次對土壤樣品直接克隆得到的gh48家族內(nèi)切纖維素酶基因進行了原核表達和純化。酶學性質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)重組酶cel48_hm01/cel48_hm02具有一定的嗜酸性和熱穩(wěn)定性,最適反應ph和最適反應溫度分別為6.0,50℃;在ph8.0-10.0范圍內(nèi)及70℃下處理3h均能保持50%以上酶活。一定濃度的na+,k+,ca2+,fe3+等金屬離子能夠顯著促進酶活,此外重組酶還具有較好的底物特異性。同源建模結(jié)果顯示,重組酶cel48_hm01/cel48_hm02與clostridiumcellulolyticum的內(nèi)切纖維素酶celf(pdb:1fbw)高級結(jié)構(gòu)同源性在58%以上,且重組酶的gh48家族主要催化殘基與模板一致。這表明重組酶可能也采用了梭菌屬gh48纖維素酶的催化機制。以上研究結(jié)果為探討gh48家族蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了實驗數(shù)據(jù)支持。4.對gh5家族纖維素酶egl01進行了原核表達和性質(zhì)檢測,對其序列刪減突變體的部分酶學性質(zhì)進行了測定,并對egl01活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點進行了定點突變研究。酶學性質(zhì)檢測結(jié)果表明,ph5.0,50℃條件下egl01活性最高,ph3.0-9.0,4-50℃條件下活性穩(wěn)定。在金屬離子,有機試劑,表面活性劑和高濃度鹽離子等存在的條件下,egl01活性仍十分穩(wěn)定。3mkcl和2mnacl分別使其酶活增加到135%和139%。此外,1-4mkcl/nacl6d條件下酶活仍保持在70%以上。egl01還具有較好的底物特異性,能水解羧甲基纖維素、櫸木木聚糖、海帶多糖、濾紙和結(jié)晶纖維素,表明其具有廣泛的工業(yè)應用潛力。在對egl01序列進行分析的基礎(chǔ)上,對其c端可能和嗜酸性相關(guān)的短肽以及和底物結(jié)合有關(guān)的cbm結(jié)構(gòu)域進行了刪減突變,結(jié)果顯示“ngkliwgtepk”短肽刪除后,突變體的嗜酸性與egl01相比并未發(fā)生明顯改變,表明該短肽并非酶嗜酸性的直接結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而cbm刪減突變體在底物特異性上發(fā)生了顯著變化,喪失了對不溶性底物的降解能力,證明cbm結(jié)構(gòu)域的完整性對于egl01酶活具有的重要意義。對同源擴增獲得的egl01天然突變體進行了表達和功能分析,發(fā)現(xiàn)其基本性質(zhì)未發(fā)生明顯改變,說明這些突變位點不是gh5家族纖維素酶活性的關(guān)鍵位點。通過與現(xiàn)有g(shù)h5家族纖維素酶的比對,確定了5個位于纖維素酶“凹槽”結(jié)構(gòu)中可能與底物結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點,定點突變的結(jié)果顯示這些位點對酶活性具有重要作用,單個位點的變化即可造成酶活性的顯著降低甚至喪失,這些結(jié)果為酶的改造及作用機制的研究提供了信息。
【關(guān)鍵詞】：纖維素酶 長白山森林土壤 基因多樣性 同源擴增 表達 性質(zhì)檢測
【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S714
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-9
• 英文縮寫詞表9-13
• 第一章 前言13-45
• 1.1 生物質(zhì)與生物質(zhì)能源13-17
• 1.1.1 生物質(zhì)與生物質(zhì)能源的涵義13-14
• 1.1.2 生物質(zhì)能源的開發(fā)14-15
• 1.1.3 生物質(zhì)能源的工業(yè)生產(chǎn)15-17
• 1.2 纖維素的研究進展17-22
• 1.2.1 天然纖維素的來源17-19
• 1.2.2 纖維素的結(jié)構(gòu)19-21
• 1.2.3 纖維素的微生物降解21-22
• 1.3 纖維素酶的研究進展22-40
• 1.3.1 纖維素酶的組成和結(jié)構(gòu)22-24
• 1.3.2 纖維素酶的家族劃分24-28
• 1.3.3 纖維素酶的作用機制28-31
• 1.3.4 纖維素酶的分子研究31-33
• 1.3.5 宏基因組學技術(shù)在纖維素酶基因克隆中的應用33-40
• 1.4 土壤微生物資源和長白山自然保護區(qū)微生物資源研究概況40-43
• 1.4.1 土壤微生物資源40-41
• 1.4.2 土壤微生物研究進展41-42
• 1.4.3 長白山自然保護區(qū)概況42
• 1.4.4 長白山森林土壤微生物資源研究概況42-43
• 1.5 立題依據(jù)及研究內(nèi)容43-45
• 1.5.1 立題依據(jù)43
• 1.5.2 研究內(nèi)容43-45
• 第二章 長白山森林土壤環(huán)境纖維素酶基因多樣性研究45-76
• 2.1 實驗材料45-47
• 2.1.1 樣品采集和處理45
• 2.1.2 試劑盒及藥品45-46
• 2.1.3 培養(yǎng)基與試劑配制46-47
• 2.1.4 儀器設(shè)備47
• 2.1.5 所用引物47
• 2.1.6 引物合成及質(zhì)粒測序47
• 2.2 實驗方法47-50
• 2.2.1 土壤微生物宏基因組DNA的提取和純化47-48
• 2.2.2 土壤纖維素酶活力檢測48
• 2.2.3 GH7_cbhI和GH48家族纖維素酶基因片段擴增及文庫構(gòu)建48-49
• 2.2.4 GH7_cbhI和GH48家族纖維素酶基因多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析49-50
• 2.3 實驗結(jié)果50-71
• 2.3.1 長白山土壤樣品的理化性質(zhì)測定50-51
• 2.3.2 土壤微生物宏基因組DNA的提取和純化51-52
• 2.3.3 GH7_cbhI和GH48家族纖維素酶基因片段的擴增及文庫構(gòu)建52-54
• 2.3.4 GH7_cbhI和GH48家族纖維素酶基因多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析54-71
• 2.4 討論71-74
• 2.5 本章小結(jié)74-76
• 第三章 長白山森林土壤纖維素酶基因克隆和序列分析76-96
• 3.1 實驗材料76-77
• 3.1.1 模板DNA76
• 3.1.2 實驗菌株,載體,工具酶以及試劑76
• 3.1.3 引物合成及DNA測序76-77
• 3.2 實驗方法77-81
• 3.2.1 GH48家族纖維素酶基因的克隆77-80
• 3.2.2 GH5家族纖維素酶基因的克隆80-81
• 3.2.3 克隆基因的轉(zhuǎn)化和測序81
• 3.2.4 克隆基因的序列分析81
• 3.3 實驗結(jié)果81-92
• 3.3.1 GH48家族纖維素酶基因的克隆和序列分析81-88
• 3.3.2 纖維素酶基因egl01的克隆和序列分析88-92
• 3.4 討論92-94
• 3.5 本章小結(jié)94-96
• 第四章 新的GH48家族纖維素酶基因的表達及性質(zhì)研究96-120
• 4.1 實驗材料96-98
• 4.1.1 實驗菌株和質(zhì)粒96
• 4.1.2 培養(yǎng)基、試劑盒和工具酶96
• 4.1.3 溶液配制和藥品96-98
• 4.1.4 儀器設(shè)備98
• 4.1.5 質(zhì)粒DNA測序98
• 4.2 實驗方法98-103
• 4.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建98-99
• 4.2.2 重組蛋白的原核表達和電泳檢測99-101
• 4.2.3 重組蛋白的純化及復性101
• 4.2.4 重組蛋白的蛋白濃度測定101-102
• 4.2.5 重組蛋白的纖維素酶活測定102
• 4.2.6 重組蛋白的酶學性質(zhì)測定102-103
• 4.2.7 重組蛋白的同源模建103
• 4.3 實驗結(jié)果103-118
• 4.3.1 重組酶的原核表達與純化103-107
• 4.3.2 重組酶的酶學性質(zhì)研究107-114
• 4.3.3 重組酶的同源模建114-118
• 4.4 討論118-119
• 4.5 本章小結(jié)119-120
• 第五章 GH5家族纖維素酶基因的表達及性質(zhì)研究120-146
• 5.1 實驗材料120-121
• 5.1.1 實驗菌株和質(zhì)粒120-121
• 5.1.2 培養(yǎng)基和緩沖液121
• 5.1.3 試劑和工具酶121
• 5.1.4 儀器設(shè)備121
• 5.1.5 質(zhì)粒DNA測序121
• 5.2 實驗方法121-125
• 5.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建121
• 5.2.2 重組蛋白的原核表達121-122
• 5.2.3 重組蛋白的純化122
• 5.2.4 重組蛋白的蛋白濃度測定122
• 5.2.5 重組蛋白的纖維素酶活測定122
• 5.2.6 重組蛋白的酶學性質(zhì)測定122-123
• 5.2.7 重組酶Egl01序列刪減突變體的構(gòu)建123
• 5.2.8 重組酶Egl01關(guān)鍵氨基酸的定點突變123-125
• 5.3 實驗結(jié)果125-142
• 5.3.1 重組酶的原核表達與純化125-127
• 5.3.2 重組酶的酶學性質(zhì)研究127-133
• 5.3.3 重組酶Egl01突變體的酶學性質(zhì)133-136
• 5.3.4 重組酶Egl01的定點突變136-142
• 5.4 討論142-144
• 5.5 本章小結(jié)144-146
• 全文總結(jié)146-148
• 參考文獻148-168
• 致謝168-170
• 在學期間公開發(fā)表論文及著作情況170

【參考文獻】

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