本文關(guān)鍵詞：水稻T-DNA插入突變體庫構(gòu)建與利用及miRNA基因功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻是重要的糧食作物又是禾本科的模式植物,研究水稻基因功能對水稻遺傳改良和保障國家糧食安全均具有重大的意義。突變體是研究基因功能最直接有效的途徑之一,但是自然突變因頻率過低已不能滿足科研的需求。人工高頻地引入突變,并在基因組規(guī)模上構(gòu)建突變體庫將是解決這一矛盾的主要方法。T-DNA插入是目前最常用的突變體庫構(gòu)建方法,T-DNA既會破壞插入位點基因的功能,又可作為標(biāo)簽用于基因分離,還可通過在T-DNA上添加不同的報告基因元件來研究插入位點基因的表達模式。本研究參與創(chuàng)建了大型水稻T-DNA插入突變體庫及小型mi RNA超表達突變體庫,為研究植物功能基因組提供了公共技術(shù)平臺。在大型T-DNA插入突變體庫創(chuàng)建與利用研究中共獲得以下3點結(jié)果:1.參與構(gòu)建了5萬株獨立轉(zhuǎn)化苗,目前本突變體庫的植株數(shù)目已超過12萬株。2.完成了3000個T1代家系的全生育期突變性狀的觀察記錄,總體突變率為33.43%,并進一步完善了突變體庫的表型數(shù)據(jù)資料。通過T-DNA插入與表型的初步共分離檢測獲得了一批有研究價值的材料,已從中獲得3個嚴格共分離家系:CZH0773(03Z11BC50)、CZH1588(03Z11CA28)、CZH1731(03Z11CE42)。3.通過對3個共分離家系的遺傳分析,本研究發(fā)現(xiàn)除T-DNA插入的破壞效應(yīng)外,T-DNA上攜帶的35S啟動子引起的基因增強與沉默亦是造成植株突變的原因之一。CZH0773家系的突變體表型為抽穗遲、半矮、葉色偏黃。T-DNA插入Os03g63050基因的3’末端。CZH1588家系突變體表現(xiàn)出抽穗遲、葉色偏黃的表型,但等位突變體及超表達和RNAi實驗都沒有出現(xiàn)突變表型。在短日條件下多個抽穗相關(guān)基因在突變體中的表達量顯著下降,而超表達Hd3a基因使突變體提前抽穗,同時突變體對GA敏感,說明Hd3a和GA的下游路徑在突變體中不受影響。CZH1731是一個矮化、分蘗多、抽穗遲的突變家系。雖然以上3個突變體的表型與T-DNA插入表現(xiàn)為嚴格的共分離,但是遺傳互補實驗發(fā)現(xiàn)互補載體與空載體均能使約一半的陽性轉(zhuǎn)化苗恢復(fù)表型,表明T-DNA插入所破壞的基因并不是造成突變的原因。本研究結(jié)果闡明,突變表型是T-DNA上的35S啟動子具有“增強子”效應(yīng)造成插入位點附近基因表達量提高引起。而35S啟動子甲基化測序結(jié)果則表明,互補載體轉(zhuǎn)化后引起的表型恢復(fù)是由于互補載體上含有的35S啟動子再次轉(zhuǎn)入時引起35S啟動子甲基化,進而抑制了35S啟動子調(diào)控的基因表達。這一推斷除了可以解釋T-DNA插入對鄰近基因的調(diào)控,還可以解釋35S啟動子對T-DNA上其它元件的調(diào)控。如T-DNA上攜帶的潮霉素基因和GUS報告基因均因為35S的驅(qū)動表現(xiàn)出高豐度的表達,但在突變體中再次引入含有35S啟動子的載體后,潮霉素抗性和GUS報告基因表達均因為35S啟動子的甲基化而被沉默。此外,較低比率的35S啟動子能夠逃逸甲基化修飾,仍表現(xiàn)出“增強子”功能,進而加深了突變體表型分析的復(fù)雜性。本研究揭示了T-DNA插入突變體中35S啟動子引發(fā)的多重效應(yīng),對攜帶35S啟動子的T-DNA插入突變體中的一些復(fù)雜現(xiàn)象給出了合理的解釋,也加深了對突變體庫的認識。本論文另一部分研究內(nèi)容是小型水稻mi RNA超表達突變體庫創(chuàng)建及基因功能研究。基于CZH1731家系突變體表型是mi R156e超量表達引起,為了系統(tǒng)研究水稻基因組中mi RNA的功能,本研究從62個mi RNA家族中成功克隆出53個基因,其中52個基因獲得超表達轉(zhuǎn)基因苗。主要研究工作有超量表達載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、表型鑒定分析及基因功能研究等。研究結(jié)果主要有以下2點:1.部分mi RNA基因超表達植株出現(xiàn)明顯突變表型。mi R319超表達植株表現(xiàn)為愈傷分化率低至約5%、陽性率約50%、植株矮小、存活率低;mi R529超表達植株表現(xiàn)為分蘗多、半矮表型;超表達mi R167植株呈現(xiàn)出分蘗角度大、頂端優(yōu)勢缺失和穗頂端退化等表型;超表達mi R160植株也出現(xiàn)分蘗角度大表型;mi R399超表達植株表現(xiàn)為株型弱小、葉片末端出現(xiàn)磷中毒而枯黃,高磷脅迫發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率比野生型高,同時mi R399靶基因的等位突變體也出現(xiàn)磷中毒表型。2.水稻mi R156的功能研究。CZH1731是從突變體庫中篩選獲得的一個矮化、分蘗多、抽穗遲和穗小的突變家系。研究表明突變表型是由于T-DNA插入造成附近mi R156e表達量提高引起。超表達osa-mi R156e和osa-mi R156e A都重現(xiàn)了突變體表型,且突變程度與基因表達量相關(guān)。czh1731M表現(xiàn)出明顯的頂端優(yōu)勢缺失表型,并影響MAX/RMS/D路徑基因的表達,推測可能存在一條通過mi R156調(diào)控水稻頂端優(yōu)勢和分蘗的新路徑。通過GAL4-UAS系統(tǒng)和Os TB1啟動子異位表達mi R156e能顯著影響水稻株型。根據(jù)研究結(jié)果反向推斷:適度降低mi R156e表達量將導(dǎo)致水稻分蘗數(shù)減少、穗大、單株產(chǎn)量提高,與理想株型相吻合,達到改良水稻株型的目的。
【關(guān)鍵詞】：水稻 T-DNA 突變體庫 35S啟動子 甲基化 miRNA osa-miR156e 株型育種
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S511
【目錄】：

• 縮寫名詞表8-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 1 文獻綜述14-38
• 1.1 植物突變體庫與功能基因組學(xué)14-26
• 1.1.1 植物功能基因組學(xué)14-15
• 1.1.2 植物功能基因組學(xué)的研究方法及技術(shù)15-23
• 1.1.2.1 基于表達譜和高通量測序技術(shù)的基因功能研究15-16
• 1.1.2.2 基于突變體庫的基因功能研究16-21
• 1.1.2.3 基于表達模式及表達量的基因功能研究21-23
• 1.1.3 T-DNA插入位點側(cè)翼序列分離方法23-25
• 1.1.4 利用突變體庫的兩種研究策略25
• 1.1.5 T-DNA插入突變體庫大小計算25-26
• 1.2 siRNA和miRNA26-35
• 1.2.1 siRNA26-30
• 1.2.1.1 siRNA的發(fā)現(xiàn)與加工過程26-27
• 1.2.1.2 siRNA的放大效應(yīng)機制27-28
• 1.2.1.3 siRNA引起的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默28
• 1.2.1.4 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默28
• 1.2.1.5 病毒誘導(dǎo)的基因沉默28-29
• 1.2.1.6 cis-acting siRNA和trans-acting siRNA29-30
• 1.2.2 miRNA30-35
• 1.2.2.1 miRNA發(fā)現(xiàn)與加工過程30-33
• 1.2.2.2 mi RNA-RISC對靶基因mRNA的抑制方式33
• 1.2.2.3 miRNA分離克隆與表達量的檢測方法33
• 1.2.2.4 植物miRNA靶基因預(yù)測與鑒定33-34
• 1.2.2.5 人工構(gòu)建miRNAs（Artificial miRNAs，amiRNAs)34
• 1.2.2.6 miRNA功能34-35
• 1.3 miR156與水稻株型35-38
• 2 本研究的目的和意義38-39
• 3 材料方法39-43
• 3.1 植物材料和生長條件39
• 3.2 突變體基因型判定與共分離檢測39
• 3.3 mi RNA超表達載體構(gòu)建39-40
• 3.4 Stem loop RT-PCR檢測miRNA的表達量40
• 3.5 RT-PCR和qRT-PCR40-41
• 3.6 載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化41
• 3.7 GAL4 UAS雙元反式激活系統(tǒng)41-42
• 3.8 GUS與GFP表達檢測42-43
• 4 結(jié)果與分析43-87
• 4.1 大型水稻T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建43
• 4.2 突變體的種植、篩選與鑒定43-61
• 4.2.1 CZH0773（03Z11BC50）家系44-47
• 4.2.1.1 czh0773M突變體表型44-45
• 4.2.1.2 共分離檢測45-46
• 4.2.1.3 czh0773M突變體互補試驗46-47
• 4.2.2 CZH1731（03Z11CE42）家系47-48
• 4.2.3 CZH1588（03Z11CA28）家系48-61
• 4.2.3.1 czh1588M突變體的獲得48-49
• 4.2.3.2 共分離檢測49-50
• 4.2.3.3 其它相關(guān)實驗50-54
• 4.2.3.4 互補實驗出現(xiàn)轉(zhuǎn)空載體恢復(fù)表型的現(xiàn)象54-55
• 4.2.3.5 35S啟動子的增強與沉默效應(yīng)造成突變表型的出現(xiàn)與消失55-58
• 4.2.3.6 35S啟動子造成載體上的GUS報告基因異常表達58-60
• 4.2.3.7 發(fā)生甲基化的細胞內(nèi)并非所有 35S啟動子位點都被甲基化60-61
• 4.2.3.8 35S啟動子甲基化測序61
• 4.3 小型miRNA超表達突變體庫的構(gòu)建61-62
• 4.4 部分miRNA超表達后的表型62-87
• 4.4.1 osa-miR319 超表達植株62
• 4.4.2 osa-miR529 超表達植株62-64
• 4.4.3 osa-miR167 超表達植株64-66
• 4.4.4 osa-miR160 超表達植株66-68
• 4.4.5 osa-miR399 超表達植株68-74
• 4.4.5.1 osa-miR399k-OX植株的獲得68
• 4.4.5.2 T0 代osa-miR399k-OX植株出現(xiàn)磷中毒表型68-69
• 4.4.5.3 T1 代轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率與轉(zhuǎn)基因陽性檢測共分離69-70
• 4.4.5.4 不同磷濃度脅迫處理，轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率高70-72
• 4.4.5.5 miR399 靶基因的等位突變體表型72-74
• 4.4.6 czh1731 突變體（03Z11CE42）與水稻株型74-87
• 4.4.6.1 矮化叢生突變體的獲得74-76
• 4.4.6.2 突變體表型是由于T-DNA插入造成osa-miR156e表達量提高引起76-78
• 4.4.6.3 超表達osa-miR156e和osa-miR156eA重現(xiàn)突變體表型78-79
• 4.4.6.4 miR156e-OX植株的突變程度與osa-miR156e的劑量相關(guān)79-81
• 4.4.6.5 超表達osa-miR156e影響MAX/RMS/D路徑81-82
• 4.4.6.6 UAS-osa-miR156e異位表達系統(tǒng)改造水稻株型82-85
• 4.4.6.7 pTB1:miR156e改良水稻株型85-87
• 5 討論87-93
• 5.1 水稻突變體庫概況87
• 5.2 35S啟動子甲基化的發(fā)現(xiàn)與利用87-89
• 5.3 T-DNA在插入突變體中的激活標(biāo)簽功能89
• 5.4 miR156 可能通過MAX/RMS/D路徑影響水稻頂端優(yōu)勢和分蘗89-90
• 5.5 miR156 可能與物種進化有關(guān)90-91
• 5.6 miR156 可作為改良水稻株型的潛在工具91-92
• 5.7 GAL4 UAS雙元反式激活系統(tǒng)在雜交后代中不穩(wěn)定92
• 5.8 本研究后續(xù)工作的展望92-93
• 參考文獻：93-107
• 附錄1 引物序列107-113
• 附錄2 國際水稻研究所水培營養(yǎng)配方113-114
• 附錄3 部分實驗的詳細步驟及試劑配方114-128
• 附錄4 作者簡歷128-129
• 致謝129-130

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Yuxiao Chang;Tuan Long;Changyin Wu;;Effort and Contribution of T-DNA Insertion Mutant Library for Rice Functional Genomics Research in China:Review and Perspective[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年12期

  本文關(guān)鍵詞：水稻T-DNA插入突變體庫構(gòu)建與利用及miRNA基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：416102