本文關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶互作蛋白的篩選及功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：艾美耳球蟲作為細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，寄生于雞腸道內(nèi)引起是由以腸道病變?yōu)橹饕卣鞯碾u球蟲病并嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。目前控制球蟲病還是主要依賴抗球蟲藥和疫苗的使用，但由于對(duì)球蟲的細(xì)胞和分子生物學(xué)等缺乏詳盡的了解，迄今尚無理想的控制雞球蟲病的藥物和疫苗。端粒酶及相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)為深入研究球蟲的細(xì)胞和分子生物學(xué)特性以及尋找新的防治雞球蟲的藥物和疫苗作用靶位等開辟了新的研究領(lǐng)域。 端粒酶作為一種核糖核蛋白，由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、端粒酶RNA和端粒酶相關(guān)蛋白三個(gè)亞單位組成，其以自身攜帶的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成新的端粒DNA重復(fù)序列以維持染色體端粒的穩(wěn)定性。而TERT是具有催化活性的亞單位。隨著對(duì)端粒酶研究的深入，先后報(bào)道了多種端粒酶相關(guān)蛋白，并發(fā)現(xiàn)這些蛋白在端粒酶活性調(diào)節(jié)過程中起重要作用。應(yīng)用酵母雙雜交篩選到的hTERT互作蛋白p23，與Hsp90共同在端粒酶的高效組裝和活化中發(fā)揮作用。PinX能與hTERT的RNA結(jié)合域（326~620aa）結(jié)合，并也能結(jié)合端粒酶RNA，在酵母中hPinX同源物是一個(gè)酵母端粒酶功能負(fù)向調(diào)節(jié)因子。四膜蟲p65和p45作為端粒酶的一部分在端粒維持方面發(fā)揮必要的作用。目前，柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）的TERT序列已經(jīng)成功克隆出來，而端粒-like序列已被預(yù)測(cè)出來。這些表明E. tenella利用傳統(tǒng)的端粒酶機(jī)制合成其端粒DNA維持染色體末端的穩(wěn)定。但尚無TERT相關(guān)蛋白的報(bào)道。故本研究通過酵母雙雜交篩選、pull-down以及免疫共沉淀技術(shù)鑒定TERT互作蛋白14-3-3，進(jìn)而利用病毒載體介導(dǎo)的錘頭狀核酶探討14-3-3在端粒酶調(diào)節(jié)中的功能。 E. tenella酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建：收集純化E. tenella孢子化卵囊，Trizol提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SMART技術(shù)建立E. tenella酵母雙雜交cDNA文庫。文庫滴度為5×107cfu/mL，容量為2×1010cfu。隨機(jī)挑選的48個(gè)克隆菌插入片段平均大小0.8~2kb，文庫重組率高。 E.tenella誘餌表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-TRBD的構(gòu)建及其互作蛋白的篩選：將PCR獲得的E. tenella TERT RNA結(jié)合域（TRBD）片段與誘餌載體pGBKT7連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-TRBD，并轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細(xì)胞中。結(jié)果表明，誘餌蛋白能在酵母菌中表達(dá)且對(duì)宿主菌無毒性作用。-半乳糖苷酶試驗(yàn)表明誘餌蛋白無自激活作用。將pGBKT7-TRBD/Y187與酵母雙雜交cDNA文庫共培養(yǎng)篩選互作蛋白，初步篩選到了TRBD互作蛋白核仁素、14-3-3和尿苷磷酸化酶。-半乳糖苷酶試驗(yàn)表明14-3-3與TRBD間存在相互作用。 TRBD與14-3-3蛋白相互作用的鑒定：將TRBD和14-3-3基因分別克隆至原核表達(dá)載體pET-32a和pGEX-4T-1，并在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)和純化。SDS-PAGE顯示二者均能以可溶性蛋白的形式表達(dá)。將純化的His-TRBD/GST-14-3-3共孵育，通過pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證兩種蛋白的相互作用。結(jié)果表明，E. tenella TRBD蛋白與14-3-3蛋白在體外具有相互作用。 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3.1-Myc-TRBD和pcDNA-3.1-HA-14-3-3，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blot顯示Myc-TRBD和HA-14-3-3均能在293T細(xì)胞中表達(dá)。免疫共沉淀結(jié)果表明Myc-TRBD蛋白與HA-14-3-3蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)具有相互作用。 14-3-3蛋白的功能研究：設(shè)計(jì)合成針對(duì)14-3-3基因的的錘頭狀核酶并連接到E. tenella病毒載體上獲得pEtV-RFP-Ham-14-3-3，進(jìn)行體內(nèi)和體外對(duì)14-3-3基因切割研究。體外試驗(yàn)表明pEtV-RFP-Ham-14-3-3體外轉(zhuǎn)錄體對(duì)14-3-3體外轉(zhuǎn)錄體切割效率達(dá)到85.24%。通過電轉(zhuǎn)染方法，將pEtV-RFP-Ham-14-3-3體外轉(zhuǎn)錄體導(dǎo)入E. tenella體內(nèi)，Western blot檢測(cè)顯示在球蟲體內(nèi)核酶對(duì)14-3-3基因具有一定的切割效率，14-3-3表達(dá)水平相對(duì)于RFP-GFP株下調(diào)11.24%。當(dāng)14-3-3基因表達(dá)被抑制后，E. tenella端粒酶活性升高，初步表明14-3-3可能對(duì)于端粒酶活性具有負(fù)向調(diào)節(jié)的作用。 綜上所述，本研究完成了E. tenella酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建并篩選到了TERT相互作用蛋白14-3-3，pull-down和免疫共沉淀結(jié)果進(jìn)一步證明了兩種蛋白的相互作用。利用E. tenella病毒載體介導(dǎo)的核酶干擾了14-3-3在球蟲體內(nèi)的表達(dá)，從而初步表明14-3-3可能對(duì)于端粒酶活性具有負(fù)向調(diào)節(jié)的作用。本研究為深入探討14-3-3調(diào)節(jié)端粒酶活性的機(jī)制以及尋找新的防治球蟲病的藥物和疫苗分子靶位奠定了重要基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：柔嫩艾美耳球蟲 酵母雙雜交 TRBD 14-3-3 蛋白相互作用 核酶 端粒酶活性
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.31
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮寫詞表10-14
• 引言14-16
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述16-38
• 第1章 雞球蟲分子生物學(xué)研究進(jìn)展16-26
• 1 基因組學(xué)16-17
• 2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)17-18
• 3 蛋白組學(xué)18-19
• 4 宿主細(xì)胞入侵19-21
• 5 雞球蟲分子生物學(xué)診斷方法21-24
• 6 球蟲防控新方法24-26
• 第2章 端粒酶及相關(guān)蛋白研究進(jìn)展26-32
• 1 端粒酶26-29
• 2 端粒酶相關(guān)蛋白29-32
• 第3章 原蟲基因功能研究方法32-38
• 1 轉(zhuǎn)染32-33
• 2 RNAi33-35
• 3 基因敲除35-36
• 4 核酶36-38
• 第二篇 研究內(nèi)容38-94
• 第1章 E. tenella 酵母雙雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建38-49
• 1 材料與方法38-44
• 2 結(jié)果44-47
• 3 討論47-48
• 4 小結(jié)48-49
• 第2章 E.tenella TERT 誘餌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其互作蛋白的篩選49-63
• 1 材料與方法49-56
• 2 結(jié)果56-61
• 3 討論61-62
• 4 小結(jié)62-63
• 第3章 TERT 與 14-3-3 蛋白相互作用的鑒定63-77
• 1 材料與方法63-69
• 2 結(jié)果69-75
• 3 討論75-76
• 4 小結(jié)76-77
• 第4章 14-3-3 蛋白的功能研究77-94
• 1 材料與方法77-85
• 2 結(jié)果85-91
• 3 討論91-93
• 4 小結(jié)93-94
• 結(jié)論94-96
• 參考文獻(xiàn)96-112
• 學(xué)術(shù)論文及發(fā)表情況112-114
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介114-116
• 作者簡(jiǎn)介116-118
• 致謝118

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶互作蛋白的篩選及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：407176