家蠶是由野桑蠶馴化而來的重要的經濟昆蟲,通過對絲蛋白基因表達調控、絲蛋白組裝機制、絲腺生長發(fā)育機理的研究,有望在提高蠶絲產量、獲得特殊性能蠶絲纖維、拓展絲腺生物反應器應用等方面取得突破。let-7是一個極其保守的microRNA(miRNA),在不同物種中都以let-7簇(let-7 cluster,let-7C)的形式存在,在時序性發(fā)育、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、細胞多能性維持等方面發(fā)揮重要的轉錄后調控功能,但let-7在家蠶絲腺中的功能目前尚不清楚。本研究利用基因編輯手段,在絲腺的不同部位實現(xiàn)let-7和let-7C敲除,驗證了它們對中部絲腺和后部絲腺生長的影響;利用轉錄組測序探索了let-7調控絲腺生長的分子機理;篩選得到let-7調控絲腺生長的靶基因,并對靶基因功能進行了研究。研究結果如下:1.家蠶絲腺miRNA研究方法探索為研究絲腺中miRNA的功能,我們試用不同方法來改變miRNA在絲腺中的表達量,以找到最適合絲腺miRNA功能研究的方法。首先以絲腺特異性表達的miR-274為研究對象,合成miR-274 mimic和miR-274 antagomir,注射到家蠶五齡幼蟲體內,但它...

【文章頁數(shù)】：158 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 概述
    1.2 絲腺發(fā)育與絲蛋白表達調控
        1.2.1 絲腺發(fā)育
        1.2.2 絲蛋白合成與分泌
    1.3 非編碼RNA研究進展
        1.3.1 非編碼RNA分類及主要功能
        1.3.2 miRNA的產生與作用機制
        1.3.3 miRNA Cluster
        1.3.4 家蠶非編碼RNA研究進展
    1.4 let-7 研究進展
        1.4.1 let-7 在發(fā)育中的調控作用
        1.4.2 let-7 在癌癥中的調控作用
        1.4.3 let-7 在細胞周期調控中的作用
    1.5 miRNA功能研究方法
        1.5.1 基于大數(shù)據(jù)的miRNA研究方法
        1.5.2 基于化學合成和轉基因技術的miRNA研究方法
        1.5.3 基于基因編輯技術的miRNA研究方法
第二章 引言
    2.1 研究目的與意義
    2.2 科學問題及主要研究內容
    2.3 技術路線
第三章 家蠶絲腺miRNA研究方法探索
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要儀器與試劑
        3.1.3 實驗方法與步驟
    3.2 結果與分析
        3.2.1 功能試劑注射及效果檢測
        3.2.2 miR-274 sponge特異性下調miR-274
        3.2.3 miR-274轉基因過表達
        3.2.4 利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術敲除miR-274
    3.3 總結與討論
第四章 家蠶let-7C miRNA抑制家蠶細胞增殖
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 主要儀器與試劑
        4.1.3 實驗方法與步驟
    4.2 結果與分析
        4.2.1 let-7C miRNAs的在不同發(fā)育時期的家蠶個體和組織中的表達譜分析
        4.2.2 let-7C miRNAs在五齡幼蟲絲腺中的時序表達
        4.2.3 let-7C miRNAs對家蠶Bm E細胞增殖的影響
        4.2.4 let-7C miRNAs對家蠶Bm Ns細胞增殖的影響
    4.3 總結與討論
第五章 let-7C miRNA敲除對中部絲腺生長的影響
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 主要儀器與試劑
        5.1.3 實驗方法與步驟
    5.2 結果與分析
        5.2.1 敲除let-7和let-7C雙gRNA表達品系
        5.2.2 中部絲腺let-7和let-7C敲除個體
        5.2.3 let-7及l(fā)et-7C敲除促進中部絲腺生長
        5.2.4 中部絲腺敲除let-7和let-7C后的表型差異
        5.2.5 中部絲腺敲除let-7和let-7C對家蠶吐絲的影響
    5.3 總結與討論
第六章 let-7C miRNA對后部絲腺生長的影響
    6.1 材料與方法
        6.1.1 材料
        6.1.2 主要儀器與試劑
        6.1.3 實驗方法與步驟
    6.2 結果與分析
        6.2.1 let-7和let-7C后部絲腺敲除個體獲取
        6.2.2 let-7 敲除對后部絲腺生長的影響
        6.2.3 let-7C敲除對后部絲腺生長的影響
        6.2.4 敲除后部絲腺let-7和let-7C產生的表型差異
        6.2.5 let-7和let-7C敲除促進后部絲腺細胞核內復制
        6.2.6 過表達let-7C miRNA對絲腺生長的影響
    6.3 總結與討論
第七章 let-7 調控絲腺生長的分子機理初探
    7.1 材料與方法
        7.1.1 材料
        7.1.2 主要儀器與試劑
        7.1.3 實驗方法與步驟
    7.2 結果與分析
        7.2.1 絲腺RNA提取及質量檢測
        7.2.2 測序數(shù)據(jù)質量評估
        7.2.3 基因表達分析
        7.2.4 差異表達基因聚類分析
        7.2.5 差異表達基因GO和 Pathway富集分析
    7.3 總結與討論
第八章 let-7 靶基因鑒定及功能研究
    8.1 材料與方法
        8.1.1 材料
        8.1.2 主要儀器與試劑
        8.1.3 實驗方法與步驟
    8.2 結果與分析
        8.2.1 let-7 靶基因預測
        8.2.2 let-7 表型相關靶基因篩選
        8.2.3 表型相關靶基因表達分析、3’UTR及雙熒光素酶報告系統(tǒng)
        8.2.4 let-7 靶基因驗證
        8.2.5 靶位點有效性驗證
        8.2.6 過表達PC對絲腺生長的影響
        8.2.7 敲除PC對絲腺生長的影響
    8.3 總結與討論
第九章 綜合與結論
論文創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
發(fā)表文章和參研課題
致謝



本文編號：3983644