發(fā)布時間：2017-05-26 14:15

  本文關(guān)鍵詞：杜仲4種活性成分合成系列基因多樣性及序列特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我國特有的名貴藥用樹種,葉片、雄蕊、果實、樹皮中含有苯丙素類(綠原酸)、黃酮類(槲皮素、山奈酚)、不飽和脂肪酸(α-亞麻酸)、環(huán)烯醚萜類、木質(zhì)素類等活性成分,具有補肝腎、強筋骨、安胎、抗菌消炎、降血壓和血脂等作用,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品等行業(yè)。目前,杜仲育種的重要目標和技術(shù)難點是提高這些活性成分的含量,因此,摸清楚杜仲重要成分合成關(guān)鍵酶基因多樣性和表達調(diào)控規(guī)律具有重要作用。本研究以杜仲國審良種‘華中6號’的果實和葉片為實驗材料,通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)了綠原酸、α-亞麻酸、槲皮素和山奈酚等4種活性成分合成系列基因的遺傳多樣性和表達調(diào)控規(guī)律,通過分析四種物質(zhì)主要家族成員的cDNA全長理化特性和結(jié)構(gòu)特點,為這4種活性成分高效積累機理的進一步研究提供理論依據(jù)。1、獲得了“華仲6號”杜仲品種大量表達基因的重要信息及序列：106,264,108個reads、7,491,046,464 Nucleotides (nt).1,316,317個Contig、292,591個Scaffold、185403個Unigene片段；對All-Unigene功能注釋分別獲得了67,119個、67119個和4,948個CDS、protein和EST的Unigene; GO、COG、KEGG分類分別注釋了72,893、42,359、43,715個Unigene,為杜仲次生代謝物積累的分子機理研究奠定了良好的基礎(chǔ)。2、杜仲綠原酸合成途徑共涉及27條基因,其中幼果和葉片表達量顯著差異的基因20條。苯丙氨酸脫氨酶(PAL)是關(guān)鍵酶基因,在杜仲中遺傳多樣性非常高,基因家族中至少包含12個成員,幼果和葉片均有表達；EuPAL3-EuPAL12基因果實表達量顯著高于葉片；葉片以EuPAL1和EuPAL1為主,而果實中多個EuPAL大量表達,調(diào)控機制極其復(fù)雜；鑒定了EuPAL1全長cDNA,長度2133bp,編碼711個aa,分子量77.14 kD,等電點6.24,為穩(wěn)定的疏水性蛋白,二級結(jié)構(gòu)以a-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型結(jié)構(gòu),隸屬lyase-I-like蛋白超家族。杜仲肉桂酸-4-羥化酶(C4H)基因至少包含EuC4H1、EuC4H2兩個家族成員,在果實和葉片中均以EuC41高表達為主,果實比葉片分別高105.25倍和6.32倍的顯著差異,；鑒定了EuC4H1和EuC4H2全長cDNA分別1641bp和1611bp,編碼547和537個aa,分子量分別為62.94 kD和60.96kD,等電點分別為9.34和8.85,均為疏水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì),EuC4H2為分泌蛋白,兩者均以α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型結(jié)構(gòu)蛋白,隸屬Cypx超家族。杜仲香豆酰-CoA連接酶(4CL)基因為多基因家族,至少包含11個家族成員；在幼果和葉片中Eu4CL1、Eu4CL4-Eu4CL6、Eu4CL8基因的表達量具有顯著差異,幼果均比葉片高；Eu4CL9-Eu4CL11基因表現(xiàn)為幼果重特異表達；幼果和葉片Eu4CL1-Eu4CL6等6個成員大量表達,表達調(diào)控規(guī)律極其復(fù)雜；Eu4CL1全長cDNA1692bp,編碼564個aa,分子量61.94 kD,等電點6.17,親水性穩(wěn)定蛋白質(zhì),以α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),隸屬AFD-class-I超家族；杜仲莽草酸羥基肉桂酸酰轉(zhuǎn)移酶(HCT)基因至少包括3個成員,葉片和果實均有表達,但僅EuHCT1基因表達量有顯著差異；幼果以EuHCT1,葉片以EuHCT1為主；HCT全長cDNA為1338bp,編碼446個aa,分子量50.08 kD,等電點9.19,疏水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì),形成以α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型二級結(jié)構(gòu)。3、在幼果和成熟果實中獲得a-亞麻酸合成相關(guān)酶基因13條,差異表達基因6條,葉片和幼果差異表達基因3條；�；鵄CP硫脂酶(FatA)基因在幼果和成熟果實表達量無顯著差異；杜仲EuFatA基因全長cDNA為1338bp,編碼446個aa,分子量為50.59 kD,理論等電點為8.07,主要以α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),分屬于CAP-ED超家族。硬脂酰-ACP去飽和酶(SAD)基因至少由4個家族成員組成,在成熟果實中均有表達,而幼果中只有EuSAD1表達,幼果和成熟果實均以EuSAD1為主；8-12脂肪酸脫氫酶(FAD2)遺傳多樣性較高,至少由5個家族成員組成,寤FAD2-1和寤FAD2-2在幼果和成熟果實中表達量達到顯著水平,EuFAD2-1-EuFAD2-3的表達量果實高于葉片,而EuFAD2-4和EuFAD2-5幼果高于成熟果實,調(diào)控機理較復(fù)雜；杜仲EuFAD2-1基因全長cDNA為993bp,編碼331個aa,分子量為38.04 kD,理論等電點為9.26,疏水性的不穩(wěn)定蛋白質(zhì),二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占、β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),FAD酶家族。omega-3脂肪酸脫氫酶(FAD3)基因至少由6個成員組成,僅有EuFAD3-6表達量有顯著差異：成熟果實2/3的基因(EuFAD3-1、EuFAD3-4-EuFAD3-6)的表達量超過幼果；鑒定EuFAD3基因,其全長cDNA為1278bp,編碼426個aa,分子量為49.18 kD,理論等電點為7.43,屬于穩(wěn)定、疏水性的泌蛋白,二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),FAD酶家族；4、在幼果和成熟葉片中獲得槲皮素和山奈酚合成相關(guān)酶11條,其中差異表達基因8條；獲得查爾酮合酶(CHS)家族成員3個,EuCHS1和EuCHS2在葉片和幼果表達量存在顯著差異,葉片EuCHS1的表達量比果實高7.88倍,而EuCHS2果實表達量比葉片高6.56倍,葉片以EuCHS1為主,而果實以EuCHS2為主；EuCHS1, cDNA全長為1191bp,編碼397個氨基酸,分子量為43.33 kD,理論等電點為6.23,疏水性穩(wěn)定蛋白質(zhì),二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型結(jié)構(gòu),屬cond-enzymes超家族。杜仲查爾酮異構(gòu)酶EuCHI在葉片和幼果均有表達,但表達量未達到顯著水平,獲得了1條CHI-like protein,在葉片和幼果表達量有顯著差異：杜仲EuCHI, cDNA全長為777bp,編碼259個氨基酸,分子量為27.63 kD,等電點為4.81,疏水性穩(wěn)定蛋白質(zhì),EuCHI二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)、α-螺旋和β-折疊為主的混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),chalone超家族。杜仲黃烷酮3-羥化酶EuF3H在葉片和果實均有表達,但表達量無顯著差異；杜仲類黃酮3'-羥化酶EuF3'H在葉片和果實均有表達,但表達量無顯著差異；EuF3'H基因其全長cDNA為1551bp,編碼517個氨基酸,EuF3'H分子量為56.71kD,理論等電點為8.72,疏水性的穩(wěn)定蛋白質(zhì),分泌蛋白,以α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合型二級結(jié)構(gòu),Cypx超家族蛋白質(zhì)。杜仲黃酮醇合成酶(FLS)有4成員,EuFLS1-EuFLS4在葉片和幼果均有表達,且均達到顯著水平,其中EuFLS3和EuFLS4在葉片中的表達量比幼果分別高出12.98倍和44.24倍,而EuFLS1和EuFLS2果實表達量比葉片分別高出15.38倍和17.65倍,故葉片以EuFLS3和EuFLS4為主,而果實則以EuFLS1和EuFLS2為主。
【關(guān)鍵詞】：杜仲 轉(zhuǎn)錄組 綠原酸 a-亞麻酸 槲皮素 全長cDNA
【學位授予單位】：中南林業(yè)科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S567.19;Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 縮略詞11-19
• 1 文獻綜述19-43
• 1.1 杜仲的特點、分布及作用19-23
• 1.1.1 杜仲的起源與分布19-20
• 1.1.2 杜仲形態(tài)發(fā)育20
• 1.1.3 杜仲培育技術(shù)20-21
• 1.1.4 杜仲膠的利用21-22
• 1.1.5 杜仲藥理作用22
• 1.1.6 杜仲功能食品的開發(fā)22-23
• 1.1.7 杜仲功能飼料的開發(fā)23
• 1.2 轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)研究進展23-31
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄組研究的主要技術(shù)方法及其原理23
• 1.2.2 基因芯片23-25
• 1.2.3 基因表達系列分析25-26
• 1.2.4 大規(guī)模平行信號測序系統(tǒng)26
• 1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)26-29
• 1.2.6 轉(zhuǎn)錄組研究的主要應(yīng)用29-31
• 1.3 杜仲重要次生代謝物質(zhì)31-41
• 1.3.1 苯丙素和木脂素類化合物32-35
• 1.3.2 α-亞麻酸35-38
• 1.3.3 黃酮類物質(zhì)38-39
• 1.3.4 萜類物質(zhì)39-41
• 1.4 項目來源與經(jīng)費支持41
• 1.5 研究的目的意義41-43
• 2 材料與方法43-50
• 2.1 實驗材料43
• 2.1.1 植物材料43
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備43
• 2.2 轉(zhuǎn)錄組分析的實驗方法和技術(shù)路線43-50
• 2.2.1 杜仲樣品RNA提取44-45
• 2.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序方法45
• 2.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝方法45-46
• 2.2.4 Unigene功能注釋方法和流程46-49
• 2.2.5 本研究總的技術(shù)路線49-50
• 3 杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝和功能注釋50-73
• 3.1 杜仲葉片和果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝50-56
• 3.1.1 Contig片段組裝50-52
• 3.1.2 Scaffold片段組裝52-53
• 3.1.3 Unigene數(shù)據(jù)組裝53-56
• 3.2 杜仲轉(zhuǎn)錄組功能注釋56-69
• 3.2.1 杜仲轉(zhuǎn)錄組cds的blast分析56-59
• 3.2.2 杜仲葉片和果實轉(zhuǎn)錄組的COG分析59-62
• 3.2.3 Unigene的基因功能分類62-65
• 3.2.4 杜仲轉(zhuǎn)錄組的KEGG代謝途徑分類65-69
• 3.3 小結(jié)與討論69-73
• 3.3.1 小結(jié)69-70
• 3.3.2 討論70-73
• 4 杜仲綠原酸生物合成途徑基因多樣性及全長CDNA特征73-112
• 4.1 杜仲轉(zhuǎn)錄組中綠原酸生物合成途徑中被注釋的UNIGENE基因74
• 4.2 杜仲葉片和果實綠原酸合成途徑系列基因的確定74-78
• 4.3 杜仲綠原酸合成系列基因多樣性及全長cDNA特征78-84
• 4.3.1 EuPAL基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律78-80
• 4.3.2 EuC4H基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律80-81
• 4.3.3 Eu4CL基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律81-83
• 4.3.4 EuHCT基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律83-84
• 4.4 EUPAL基因全長cDNA序列特征84-91
• 4.4.1 EuPAL基因與其他植物種的相似性84-86
• 4.4.2 EuPAL編碼蛋白質(zhì)的理化特性86
• 4.4.3 EuPAL編碼蛋白的疏水/親水性分析86
• 4.4.4 EuPAL編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測86-88
• 4.4.5 EuPAL編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測88-89
• 4.4.6 PAL基因系統(tǒng)進化樹89-91
• 4.5 EUC4H基因全長cDNA序列特征91-98
• 4.5.1 EuC4H基因與其他植物種序列相似性91-92
• 4.5.2 EuC4H編碼蛋白的理化特性92
• 4.5.3 EuC4H編碼蛋白的疏水/親水性分析92-93
• 4.5.4 EuC4H編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測93-95
• 4.5.5 EuC4H編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)95
• 4.5.6 C4H基因系統(tǒng)進化樹95-98
• 4.6 Eu4CL基因全長cDNA序列特征98-102
• 4.6.1 Eu4CL基因的鑒定98
• 4.6.2 Eu4CL編碼蛋白的理化特性98-99
• 4.6.3 Eu4CL編碼蛋白的疏水/親水性分析99
• 4.6.4 Eu4CL編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測99-100
• 4.6.5 Eu4CL編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測100-101
• 4.6.6 4CL基因的系統(tǒng)進化樹101-102
• 4.7 EUHCT基因全長cDNA序列特征102-108
• 4.7.1 EuHCT基因與其他植物種序列相似性102-103
• 4.7.2 EuHCT編碼蛋白的理化特性103
• 4.7.3 EuHCT編碼蛋白的疏水/親水性分析103-104
• 4.7.4 EuHCT編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測104
• 4.7.5 EuHCT編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)104-105
• 4.7.6 HCT基因系統(tǒng)進化樹105-108
• 4.8 小結(jié)與討論108-112
• 4.8.1 小結(jié)108-110
• 4.8.2 討論110-112
• 5 杜仲α-亞麻酸生物合成系列基因多樣性及全長CDNA特征112-136
• 5.1 杜仲α-亞麻酸生物合成途徑中注釋的UNIGENE112-114
• 5.1.1 幼果和成果中α-亞麻酸生物合成途徑中注釋的Unigene112-114
• 5.1.2 葉片和幼果中α-亞麻酸生物合成途徑中注釋的Unigene114
• 5.2 杜仲α-亞麻酸生物合成關(guān)鍵酶基因的確定114-116
• 5.2.1 幼果和成果中α-亞麻酸生物合成關(guān)鍵酶基因的確定114-115
• 5.2.2 幼果和葉片中α-亞麻酸生物合成相關(guān)酶基因的確定115-116
• 5.3 杜仲α-亞麻酸合成系列基因的多樣性及表達規(guī)律116-121
• 5.3.1 EuFatA基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律116-117
• 5.3.2 EuSAD基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律117-118
• 5.3.3 EuFAD2基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律118-120
• 5.3.4 EuFAD3基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律120-121
• 5.4 EUFATA基因的cDNA全長序列特征121-126
• 5.4.1 EuFatA基因的鑒定121
• 5.4.2 EuFatA編碼蛋白的理化特性121
• 5.4.3 EuFatA編碼蛋白的疏水/親水性分析121-122
• 5.4.4 EuFatA編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測122-123
• 5.4.5 EuFatA編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)123-124
• 5.4.6 FatA基因系統(tǒng)進化樹124-126
• 5.5 EUSAD基因全長cDNA序列特征126-129
• 5.5.1 SAD基因的鑒定126
• 5.5.2 EuSAD編碼蛋白的理化特性126
• 5.5.3 EuSAD編碼蛋白的疏水/親水性分析126-127
• 5.5.4 EuSAD編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測127-128
• 5.5.5 EuSAD編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)128-129
• 5.5.6 SAD基因系統(tǒng)進化樹129
• 5.6 EUFAD3基因全長cDNA序列特征129-134
• 5.6.1 EuFAD3基因的鑒定129-130
• 5.6.2 EuFAD3編碼蛋白的理化特性130
• 5.6.3 EuFAD3編碼蛋白的疏水/親水性分析130-131
• 5.6.4 EuFAD3編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測131-132
• 5.6.5 EuFAD3編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)132
• 5.6.6 FAD3基因系統(tǒng)進化樹132-134
• 5.7 小結(jié)與討論134-136
• 5.7.1 小結(jié)134-135
• 5.7.2 討論135-136
• 6 杜仲槲皮素和山奈酚生物合成途徑相關(guān)酶基因特征136-162
• 6.1 杜仲轉(zhuǎn)錄組中槲皮素和山奈酚合成途徑中被注釋的UNIGENE基因137-139
• 6.2 杜仲槲皮素、山奈酚合成途徑相關(guān)酶基因的確定139-141
• 6.3 杜仲槲皮素、山奈酚合成系列基因的多樣性及表達規(guī)律141-145
• 6.3.1 EuCHS基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律141-142
• 6.3.2 EuCHI基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律142-143
• 6.3.3 EuF3H基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律143-144
• 6.3.4 EuF3'H基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律144
• 6.3.5 EuFLS基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律144-145
• 6.4 EUCHS基因cDNA序列特征145-151
• 6.4.1 EuCHS基因的鑒定145-146
• 6.4.2 EuCHS編碼蛋白的理化特性146
• 6.4.3 EuCHS編碼蛋白的疏水/親水性分析146-147
• 6.4.4 EuCHS編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測147-148
• 6.4.5 EuCHS編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)148
• 6.4.6 CHS基因系統(tǒng)進化樹148-151
• 6.5 EUCHI基因的序列特征151-154
• 6.5.1 EuCHI基因cDNA全長序列鑒定151
• 6.5.2 EuCHI編碼蛋白的理化特性151
• 6.5.3 EuCHI編碼蛋白的疏水/親水性分析151-152
• 6.5.4 EuCHI編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測152-153
• 6.5.5 EuCHI編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測153
• 6.5.6 EuCHI基因系統(tǒng)進化樹153-154
• 6.6 EUF3'H基因的全長cDNA序列特征154-159
• 6.6.1 EuF3'H基因的鑒定154-155
• 6.6.2 EuF3'H編碼蛋白的理化特性155
• 6.6.3 EuF3'H編碼蛋白的疏水/親水性分析155-156
• 6.6.4 EuF3'H編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測156-157
• 6.6.5 EuF3'H編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測157
• 6.6.6 EuF3'H基因系統(tǒng)進化樹157-159
• 6.7 小結(jié)與討論159-162
• 6.7.1 小結(jié)159-160
• 6.7.2 討論160-162
• 7 結(jié)論與創(chuàng)新點162-166
• 7.1 結(jié)論162-164
• 7.2 創(chuàng)新點164-166
• 參考文獻166-187
• 攻讀學位期間的主要學術(shù)成果187-188
• 致謝188

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉攀峰;杜仲MEP途徑系列基因全長cDNA分離鑒定及序列特征研究[D];中國林業(yè)科學研究院;2012年

  本文關(guān)鍵詞：杜仲4種活性成分合成系列基因多樣性及序列特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：397094