豬既是一種在我國畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有極大比重的重要經(jīng)濟動物,同時還是生物醫(yī)學中常用的理想醫(yī)學模型。然而豬多能干細胞(pluripotent stem cells,PSCs)的建系仍未完全成功,并且對其多能調(diào)控機制的了解尚不清楚。因此,深入研究豬多能干細胞的多能調(diào)控機制,將為豬多能干細胞的建系提供理論基礎(chǔ)。H3K9甲基化修飾是重要的表觀抑制標記,在小鼠上的研究表明其是重編程過程中重要的表觀障礙。而組蛋白去甲基化酶KDM3A和KDM3B可通過羥基化作用去除H3K9me1/2來維持干細胞的自我更新能力。因此,研究兩者在豬多能干細胞中的功能機制,將更深入了解H3K9甲基化對多能干細胞的調(diào)控方式,并有利于解決當前豬內(nèi)源多能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)激活不完全的問題。在本研究中,我們以實驗室已建立的以藥物介導(dǎo)的外源基因表達的豬誘導(dǎo)性多能干細胞為實驗材料,分析了H3K9甲基化修飾狀態(tài)轉(zhuǎn)換對其自我更新能力的影響,并揭示了以KDM3A/KDM3B/OCT4/SOX2為核心的H3K9去甲基化調(diào)控機制。實驗結(jié)果如下:1.全基因組水平的H3K9的低甲基化狀態(tài)對于豬i PSCs多能性的維持至關(guān)重要。本研究以DOX-i PSCs為研究...

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
文獻綜述
    第一章 多能干細胞研究進展
        1.1 多能干細胞的建立及分類
            1.1.1 多能干細胞的概述
            1.1.2 胚胎干細胞研究進展
            1.1.3 細胞重編程的研究進展
                1.1.3.1 誘導(dǎo)性多能干細胞的建立
                1.1.3.2 豬誘導(dǎo)性多能干細胞的研究進展
        1.2 多能干細胞的維持機制研究
            1.2.1 多能性核心轉(zhuǎn)錄因子的研究進展
                1.2.1.1核心轉(zhuǎn)錄因子Oct4
                1.2.1.2核心轉(zhuǎn)錄因子Sox2
            1.2.2 多能性調(diào)控通路
                1.2.2.1 細胞因子維持多能性
                1.2.2.2 小分子抑制劑維持多能性
                    1.2.2.2.1 Wnt信號通路與多能性維持
                    1.2.2.2.2 MAPK/Erk信號通路與多能性維持
                    1.2.2.2.3 TGFβ/SMAD信號通路抑制劑SB431542
                1.2.2.3 MEF飼養(yǎng)層細胞
    第二章 H3K9甲基化修飾的研究進展
        2.1 細胞重編程過程中的表觀遺傳調(diào)控
            2.1.1 表觀遺傳學
            2.1.2 DNA甲基化修飾
            2.1.2 組蛋白共價修飾
                2.1.3.1 組蛋白乙酰化修飾
                2.1.3.2 組蛋白甲基化修飾
        2.2 H3K9甲基化及功能
        2.3 多能態(tài)建立過程中H3K9甲基化的作用
        2.3 組蛋白去甲基化酶的研究進展
        2.4 組蛋白去甲基化酶KDM3A與 KDM3B的研究進展
        2.5 多能態(tài)建立過程中組蛋白去甲基化酶KDM3A與 KDM3B的作用
        2.6 小結(jié)與展望
試驗研究
    第三章 豬iPSCs多能態(tài)轉(zhuǎn)換過程中H3K9 甲基化的變化規(guī)律
        3.1 材料和方法
            3.1.1 試驗材料
            3.1.2 試驗方法
        3.2 結(jié)果
            3.2.1 撤去DOX及多能培養(yǎng)體系對豬DOX-i PSCs的影響
            3.2.2 piPSCs多能性喪失過程中H3K9與H3K4 甲基化修飾水平的變化
            3.2.3 篩選影響H3K9甲基化的主要因素
            3.2.4 F-與FD-處理下pi PSCs表型檢測
            3.2.5 F-與FD-處理下pi PSCs多能基因檢測
            3.2.6 F-與FD-處理下pi PSCs組蛋白甲基化修飾水平的變化
        3.3 討論
        3.4 小結(jié)
    第四章 Feeder與外源基因協(xié)同維持豬i PSCs多能性機制解析
        4.1 材料和方法
            4.1.1 試驗材料
            4.1.2 試驗方法
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序揭示F-與FD-組的基因表達變化
            4.2.2 功能富集分析揭示整個分化過程中轉(zhuǎn)錄變化
            4.2.3 H3K9me2/me3 在基因組上的分布情況
            4.2.4 Ch IP-seq分析分化過程中H3K9me2和H3K9me3 的變化情況
            4.2.5 多能性喪失過程中H3K9 甲基化motif變化分析。
            4.2.6 H3K9甲基化與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析揭示其作用機理
        4.3 討論
        4.4 小結(jié)
    第五章 KDM3A與 KDMB協(xié)同調(diào)節(jié)H3K9 甲基化修飾維持豬多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
        5.1 材料和方法
            5.1.1 試驗材料與耗材
            5.1.2 試驗方法
        5.2 結(jié)果
            5.2.1 KDM3A與 KDM3B共干擾導(dǎo)致豬i PSCs喪失多能性
            5.2.2 豬i PSCs中共干擾KDM3A與 KDM3B后的轉(zhuǎn)錄組變化
            5.2.2 干擾KDM3A與 KDM3B抑制PI3K-AKT信號通路影響多能性
            5.2.4 KDM3A與 KDM3B過表達對豬i PSCs多能性的影響
            5.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序揭示KDM3A與 KDM3B過表達的分子作用機制
            5.2.6 KDM3A過表達可抑制F-處理下引發(fā)的細胞分化
        5.3 討論
        5.4 小結(jié)
    第六章 轉(zhuǎn)錄因子OCT4與SOX2 是維持豬i PSCs多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心
        6.1 材料和方法
            6.1.1 試驗材料與耗材
            6.1.2 試驗方法
        6.2 結(jié)果
            6.2.1 不同DOX濃度下豬i PSCs的表型變化
            6.2.2 篩選維持豬iPSCs多能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
            6.2.3 無DOX下過表達OCT4與SOX2 維持豬i PSCs多能性
            6.2.4 Ch IP-seq揭示OCT4與SOX2 維持豬i PSCs多能性機理
            6.2.5 轉(zhuǎn)錄因子之間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建立
        6.3 討論
        6.4 小結(jié)
    第七章 OCT4/SOX2 與組蛋白去甲基化酶復(fù)合體KDM3A/3B互作維持豬i PSCs多能性
        7.1 材料和方法
            7.1.1 試驗材料與耗材
            7.1.2 試驗方法
        7.2 結(jié)果
            7.2.1 OCT4與SOX2 并未直接調(diào)控KDM3A與KDM3B的表達
            7.2.2 H3K9去甲基化作用與核心轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同關(guān)系
            7.2.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平揭示KDM3A與 OCT4/SOX2 之間的協(xié)作關(guān)系
            7.2.4 IP-MS揭示KDM3A與 KDM3B的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
        7.3 討論
        7.4 小結(jié)
結(jié)論
論文創(chuàng)新點及下一步研究方向
    創(chuàng)新點
    下一步研究方向
參考文獻
附錄
致謝
個人簡歷



本文編號：3940777