本文關鍵詞：mTORC1在金黃色葡萄球菌及其肽聚糖誘導炎性反應中的作用與機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種典型的革蘭氏陽性細菌,作為一種環(huán)境致病菌可引起群體感染。金黃色葡萄球菌可引起奶牛乳腺炎,造成奶牛產(chǎn)奶量下降,導致養(yǎng)殖業(yè)嚴重的經(jīng)濟損失。肽聚糖是金黃色葡萄球菌細胞壁的主要成分,作為一種重要的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP),是模式識別受體Toll樣受體2(toll like receptor 2, TLR2)的配體。肽聚糖與TLR2結合,導致TLR2胞內TIR結構域結合并激活MyD88 (myeloid differentiation 88),進而募集IRAK (IL-1-receptor kinase)和TRAF6 (TNF-receptor-associated factor 6),激活NF-κB (transcription factor nuclear factor, NF-κB)等轉錄因子,誘導炎性因子表達,引起炎癥反應。mTOR (mammalian target of rapamycin)是進化上十分保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶,屬于PIKK (phosphatidyl-inositol 3-kinase-related kinase)超家族,在細胞內與其它蛋白組成mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2)兩種復合體。其中mTORC1對rapamycin敏感,在天然免疫反應中具有重要作用,但mTORC1是否調控金黃色葡萄球菌及其肽聚糖誘導的炎性反應目前還不清楚。本研究選擇小鼠巨噬細胞和牛乳腺上皮細胞為研究對象,首先以金黃色葡萄球菌肽聚糖作為病原相關分子模式配體作用于小鼠巨噬細胞,探討mTORC1在調控肽聚糖誘導炎性因子的表達及巨噬細胞增殖中的作用；進而以金黃色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮細胞,通過比較蛋白質組學研究篩選出與細菌侵染相關的蛋白分子和信號轉導通路,并探討mTORC1在這一過程中的調控作用。旨在將病原相關分子模式(肽聚糖)和病原體侵染(金黃色葡萄球菌)在誘導炎性反應中的作用相互參照,以證明mTORC1在調控金黃色葡萄球菌及其肽聚糖誘導的炎性反應中的關鍵性作用及機制。本論文由兩部分組成：第一部分以金黃色葡萄球菌的肽聚糖(peptidoglycan, PGN)刺激小鼠巨噬細胞Ana-1,觀察肽聚糖對Ana-1細胞增殖的作用,檢測肽聚糖誘導Ana-1細胞分泌炎性因子(TNF-α, IL-6和IL-10)情況,以證明肽聚糖具有誘導小鼠巨噬細胞分泌炎性因子的作用。同時使用mTORC1特異性抑制劑rapamycin處理細胞,檢測mTORC1信號通路被抑制后肽聚糖誘導Ana-1細胞分泌炎性因子的變化情況,以證明mTORC1對肽聚糖誘導小鼠巨噬細胞分泌炎性因子具有調控作用。結果表明：(1)肽聚糖刺激巨噬細胞表達TNF-α, IL-6和IL-10,且具有時間和劑量依賴性。刺激Ana-1細胞最佳濃度和時間分別為25 μg/ml/6 hr;(2)使用rapamycin處理細胞抑制mTORC1活性后,肽聚糖誘導的細胞增殖和炎癥因子TNF-α, IL-6分泌減弱,而抑炎因子IL-10分泌增強。說明mTORC1在調控肽聚糖誘導的炎性因子分泌中,對炎癥因子TNF-α, IL-6和抑炎因子IL-10可能具有不同的調控機制。為探討mTORC1調控肽聚糖誘導的巨噬細胞炎性因子表達的分子機制,我們對mTOR信號通路和炎性因子基因表達相關轉錄因子展開研究。首先利用肽聚糖刺激巨噬細胞,檢測mTOR, S6,4E-BP1蛋白磷酸化水平,觀察肽聚糖是否激活mTOR信號通路；其次,分別采用TLR1和TLR2抗體封閉TLR1和TLR2,抑制其作為肽聚糖受體的功能,檢測細胞因子表達變化及mTORC1信號通路變化；最后,在轉錄因子層面上檢測轉錄因子NF-κB和STAT3活性變化情況。結果表明：(1)肽聚糖激活mTORC1信號通路,rapamycin處理后,肽聚糖誘導的mTOR及其下游效應蛋白S6,4E-BP1的磷酸化活性被抑制；(2)采用抗體封閉TLR1和TLR2后,肽聚糖激活的mTORC1信號通路和轉錄因子STAT3, NF-κB活性降低,表明TLR1和TLR2介導肽聚糖誘導的mTORC1信號通路激活和轉錄因子活化；(3)抗體封閉TLR1和TLR2后,TNF-α, IL-6和IL-10的分泌均減少,表明TLRl和TLR2介導了肽聚糖誘導的炎性因子TNF-α,IL-6和抑炎因子IL-10的表達。通過第一部分的實驗我們可以得到：金黃色葡萄球菌的肽聚糖通過結合受體TLR1和TLR2,激活mTORC1信號通路和轉錄因子NF-κB和STAT3,進而調控炎癥因子TNF-α, IL-6和抑炎因子IL-10的分泌。mTORC1在這一過程中可能通過不同的機制調控炎癥因子和抑炎因子的表達。本論文的第二部分以牛乳腺上皮細胞為研究對象,用金黃色葡萄球菌侵染細胞。實驗設非處理組,金黃色葡萄球菌侵染組,rapamycin處理組,rapamycin處理后金黃色葡萄球菌侵染組等4組,試圖通過比較各組之間的差異表達蛋白篩選出與金黃色葡萄球菌侵染相關并受mTORC1調控的炎性反應相關的細胞因子和信號通路。采用iTRAQ技術獲得了4個組的定量蛋白質組數(shù)據(jù)。通過數(shù)據(jù)的兩兩比對獲得了4個比較蛋白質組數(shù)據(jù)及其GO功能分析數(shù)據(jù)和KEGG pathway功能分析數(shù)據(jù)。從4組樣品中共鑒定出蛋白1761個；篩選出與mTORC1相關的差異表達蛋白54個,對其中可以在KEGG數(shù)據(jù)庫檢索到的蛋白22個進行了功能注釋；與細菌侵染相關的差異表達蛋白44個,對其中可以在KEGG數(shù)據(jù)庫檢索到的蛋白16個進行了功能注釋；與細菌侵染并與mTORC1相關的差異表達蛋白61個,對其中可以在KEGG數(shù)據(jù)庫檢索到的蛋白27個進行了功能注釋；與細菌侵染相關并受到mTORC1調控的差異表達蛋白58個,對其中可以在KEGG數(shù)據(jù)庫檢索到的蛋白22個進行了功能注釋。綜上所述,mTORC1信號通路在調控肽聚糖誘導的炎性反應中發(fā)揮重要作用。其可能的分子機制為肽聚糖通過TLR1和TLR2激活mTORC1通路,進而激活轉錄因子NF-κB和STAT3,調控炎性因子表達。蛋白質組學研究表明,1nTORC1可能在金黃色葡萄球菌侵染奶牛乳腺上皮細胞過程中發(fā)揮調控作用。項目研究成果豐富了病原體與宿主細胞相互作用研究領域知識,為奶牛乳腺炎的防治提供了基礎數(shù)據(jù)。
【關鍵詞】：肽聚糖 金黃色葡萄球菌 mTORC1 炎性因子 蛋白質組
【學位授予單位】：內蒙古大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.611
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 縮寫詞表14-16
• 前言16-18
• 第一章 文獻綜述18-30
• 1.1 病原體與宿主的相互作用18
• 1.2 TLRs和mTOR信號通路18-25
• 1.2.1 TLRs的結構及種類18-20
• 1.2.2 細胞表面的TLRs及其配體20-21
• 1.2.3 TLR信號轉導通路及調控分子21-23
• 1.2.4 mTOR及其復合物23-24
• 1.2.5 mTOR信號通路及功能24-25
• 1.2.6 TLRs/mTOR信號通路25
• 1.3 金黃色葡萄球菌及其病原相關分子模式25-28
• 1.3.1 金黃色葡萄球菌的免疫原特異性25-27
• 1.3.2 肽聚糖及其TLR1/2受體27-28
• 1.3.2.1 肽聚糖的結構及功能27
• 1.3.2.2 TLR2的特點及功能27-28
• 1.4 小鼠巨噬細胞和奶牛乳腺上皮細胞在免疫應答研究方面的應用28
• 1.5 比較蛋白質組學在病原體與宿主細胞相互作用研究中的應用28-30
• 第二章 mTORC1在肽聚糖誘導炎性因子表達中的調控作用與機制30-49
• 2.1 肽聚糖刺激小鼠巨噬細胞Ana-1分泌炎性因子30-36
• 2.1.1 材料30-31
• 2.1.1.1 實驗細胞30
• 2.1.1.2 主要試劑,抗體與耗材30-31
• 2.1.2 方法31-34
• 2.1.2.1 Ana-1細胞的培養(yǎng)31-32
• 2.1.2.2 肽聚糖配制32
• 2.1.2.3 肽聚糖刺激小鼠巨噬細胞32-33
• 2.1.2.4 細胞因子的檢測33-34
• 2.1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計34
• 2.1.3 結果34-36
• 2.1.3.1 肽聚糖誘導巨噬細胞分泌細胞因子具有劑量依賴性34-35
• 2.1.3.2 肽聚糖誘導巨噬細胞分泌細胞因子具有時間依賴性35-36
• 2.1.3.3 mTORC1介導肽聚糖誘導的炎性因子表達36
• 2.2 肽聚糖誘導Ana-1細胞增殖并激活mTOR信號通路36-43
• 2.2.1 材料36-38
• 2.2.1.1 實驗細胞36
• 2.2.1.2 主要試劑,抗體與耗材36-37
• 2.2.1.3 主要儀器設備37
• 2.2.1.4 溶液配方及配制37-38
• 2.2.2 方法38-41
• 2.2.2.1 細胞系和肽聚糖配制38
• 2.2.2.2 肽聚糖刺激小鼠巨噬細胞38
• 2.2.2.3 提取總蛋白38-39
• 2.2.2.4 制備樣品39
• 2.2.2.5 SDS-PAGE39-40
• 2.2.2.6 Western blot40-41
• 2.2.2.7 MTT法測定細胞增殖41
• 2.2.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計41
• 2.2.3 結果41-43
• 2.2.3.1 肽聚糖激活mTORC1信號通路和轉錄因子NF-KB41-42
• 2.2.3.2 Rapamycin抑制肽聚糖誘導的Ana-1細胞增殖42-43
• 2.3 TLR1/2介導肽聚糖誘導的mTORC1和轉錄因子NF-κB,STAT3活化及炎性因子表達43-47
• 2.3.1 材料43-44
• 2.3.1.1 實驗細胞43
• 2.3.1.2 主要試劑,抗體與耗材43-44
• 2.3.1.3 溶液配方及配制44
• 2.3.2 方法44-45
• 2.3.2.1 細胞系和肽聚糖配制44
• 2.3.2.2 TLR受體封閉及肽聚糖刺激小鼠巨噬細胞44-45
• 2.3.2.3 ELISA及Western blot操作45
• 2.3.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計45
• 2.3.3 結果45-47
• 2.3.3.1 TLR1/2封閉減弱肽聚糖誘導的細胞因子分泌45-46
• 2.3.3.2 TLR1/2封閉抑制肽聚糖誘導的mTORC1和轉錄因子NF-κB,STAT3活性46-47
• 2.4 討論47-49
• 第三章 金黃色葡萄球菌(S.aureus)侵染牛乳腺上皮細胞的比較蛋白質組學研究49-69
• 3.1 材料49-51
• 3.1.1 實驗細胞系49
• 3.1.2 實驗用的細菌49-50
• 3.1.3 主要試劑,耗材與抗體50
• 3.1.4 儀器設備50
• 3.1.5 實驗溶液配制50-51
• 3.2 方法51-55
• 3.2.1 菌株培養(yǎng)及保存51
• 3.2.2 菌落計數(shù)51
• 3.2.3 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)51-52
• 3.2.4 細胞數(shù)計52
• 3.2.5 侵染條件優(yōu)化52
• 3.2.6 細菌侵染后的菌落計數(shù)52-53
• 3.2.7 蛋白樣品制備與質量檢測53-54
• 3.2.8 iTRAQ蛋白質組測定54-55
• 3.2.9 比較蛋白質組分析和篩選55
• 3.3 結果55-68
• 3.3.1 最佳MOI及侵染時間的確定55-56
• 3.3.2 蛋白質組樣品的制備與SDS-PAGE分析56-57
• 3.3.3 蛋白質組的基本信息統(tǒng)計57-58
• 3.3.4 比較蛋白質組的信息學分析58-62
• 3.3.4.1 比較蛋白質組的基本信息分析58-59
• 3.3.4.2 比較蛋白質組的功能分析59-62
• 3.3.5 與金黃色葡萄球菌侵染及與mTORC1相關的蛋白質的篩選62-68
• 3.3.5.1 與mTORC1相關的蛋白質的篩選62-63
• 3.3.5.2 金黃色葡萄球菌侵染相關的蛋白質的篩選63-64
• 3.3.5.3 與金黃色葡萄球菌侵染并與mTORC1相關的蛋白質篩選64-66
• 3.3.5.4 與金黃色葡萄球菌侵染相關并受mTORC1調控的蛋白質篩選66-68
• 3.4 討論68-69
• 結論69-70
• 參考文獻70-79
• 致謝79-80
• 攻讀博士期間發(fā)表的學術論文80

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