本文關(guān)鍵詞：二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物作用靶標(biāo)的鑒定和驗證，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新農(nóng)藥創(chuàng)制的基礎(chǔ)是靶標(biāo)的創(chuàng)新,研究藥物作用靶標(biāo)可以為新農(nóng)藥的創(chuàng)制提供思路,而以天然產(chǎn)物為探針是發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)的主要途徑。從植物苦皮藤根皮部分離鑒定出的一系列二氫沉香呋喃多元酯類化合物具有殺蟲活性,但其作用機理尚不明確。本文以東方粘蟲幼蟲(Mythimna separata Walker)為供試?yán)ハx,對二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的作用靶標(biāo)進行了鑒定和驗證,為創(chuàng)制一類作用于昆蟲消化系統(tǒng)的新型殺蟲劑提供新的思路。主要研究方法與結(jié)果如下:1.采用靶標(biāo)鑒定的親和層析方法,以苦皮藤素V為二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的代表,在其C-6位衍生合成氨基乙酸酯,通過自發(fā)偶聯(lián)與CNBr活化的Sepharose 4B反應(yīng)生成親和基質(zhì),從粘蟲幼蟲中腸BBMV提取物中分離結(jié)合蛋白。經(jīng)質(zhì)譜鑒定,獲得11個如下結(jié)合蛋白:鋅指蛋白(Zinc finger protein)、跨膜蛋白1(Transmembrane protein 1)、硫氧還蛋白過氧化物酶(Thioredoxin peroxidase(TPx))、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、E3 SUMO-蛋白連接酶RanBP2(SUMO E3 ligase RanBP2)、肌動蛋白(actin)、氨肽酶N3(APN3)、V-ATPase a亞基、B亞基和H亞基。結(jié)合文獻已報道的前期癥狀學(xué)觀察結(jié)果及這些蛋白的功能推測可知,APN和V-ATPase為疑似靶酶。2.采用口腔直接飼喂法測定了12個供試二氫沉香呋喃多元酯類化合物對5齡粘蟲的毒力,供試化合物KV-6-N-甲基靛紅酸酯(KV-6-MIA)、KV-6-異丁酸酯、KV-6-酮、NW57、NW62在供試濃度668.45μg/g劑量下對供試5齡粘蟲不表現(xiàn)出胃毒活性;雷公藤次堿(WR)、苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、NW69、NW03、NW70對供試5齡粘蟲有胃毒活性,LD50分別為:0.597、679.479、33.605、767.811、309.559、379.286、86.271μg/g。測定了12個供試二氫沉香呋喃多元酯類化合物對粘蟲幼蟲中腸APN和V-ATPase活性的影響,結(jié)果表明,該類化合物對APN活性沒有影響,但是大多數(shù)該類化合物對V-ATPase活性有抑制作用。供試化合物苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、KV-6-異丁酸酯、KV-6-酮、KV-6-N-甲基靛紅酸酯(KV-6-MIA)、NW69、NW70、NW03、NW57、NW62、雷公藤次堿(WR)對V-ATPase活性的抑制率分別為:14.19%、19.83%、12.72%、12.30%、6.72%、24.04%、12.63%、29.64%、33.98%、1.9%、6.90%、54.78%。供試化合物的殺蟲活性與對試蟲中腸V-ATPase的抑制活性呈正相關(guān)性,說明二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的作用靶酶為V-ATPase。3.基于V-ATPase H亞基功能的重要性,采用RACE技術(shù)對粘蟲幼蟲中腸V-ATPase H亞基進行克隆。獲得了粘蟲幼蟲中腸H亞基基因1807 bp,其中CDS區(qū)基因的全長共1425 bp,5'-UTR為136 bp,3'-UTR為246 bp。CDS區(qū)編碼474個氨基酸,經(jīng)預(yù)測編碼氨基酸的分子量為54.8 KDa,等電點(pI)為6.26。4.采用微量熱泳動(MST)技術(shù),測定供試12個二氫沉香呋喃多元酯類化合物與H亞基的相互作用,結(jié)果表明KV-6-酮、KV-6-N-甲基靛紅酸酯(KV-6-MIA)、KV-6-異丁酸酯、NW57、NW62不與H亞基結(jié)合,苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、NW70、NW69、NW03、雷公藤次堿(WR)與H亞基結(jié)合,通過擬合結(jié)合曲線計算得解離常數(shù)KD值分別為:253.0、144.0、156.0、164.0、186.0、203.0、59.0μM。經(jīng)過KD值與殺蟲毒力LD50及對V-ATPase活性抑制率的相關(guān)性分析知,二氫沉香呋喃多元酯類化合物的作用靶標(biāo)是V-ATPase H亞基。5.借助Discovery Studio軟件,采用同源建模法,以已知結(jié)構(gòu)的酵母H亞基為模型,構(gòu)建了東方粘蟲幼蟲中腸V-ATPase H亞基的模型,并預(yù)測了18個可能的結(jié)合位點。利用分子對接技術(shù),將供試12個二氫沉香呋喃多元酯類化合物與H亞基模型對接,通過對接得分與KD值相關(guān)性分析可知,位于H亞基C端結(jié)構(gòu)域空腔內(nèi)的位點17(其氨基酸殘基為半光氨酸(Cys)、組氨酸(His)、色氨酸(Trp)、絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)等)為可能的作用位點。
【關(guān)鍵詞】：二氫沉香呋喃多元酯 V-ATP酶 V-ATP酶H亞基 靶標(biāo)鑒定 靶標(biāo)驗證 分子對接 東方粘蟲
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S482.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 文獻綜述15-41
• 1.1 新藥創(chuàng)制與靶標(biāo)創(chuàng)新15-18
• 1.1.1 糧食安全和環(huán)境安全需要不斷創(chuàng)制新農(nóng)藥15
• 1.1.2 我國農(nóng)藥創(chuàng)新現(xiàn)狀15-16
• 1.1.3 新農(nóng)藥創(chuàng)制的最新趨勢是基于化學(xué)蛋白組學(xué)分子靶標(biāo)導(dǎo)向的綠色農(nóng)藥創(chuàng)制16-18
• 1.2 V-ATPASE作為藥物靶標(biāo)的研究現(xiàn)狀18-34
• 1.2.1 V-ATPase的結(jié)構(gòu)與功能19-23
• 1.2.2 昆蟲V-ATPase23-27
• 1.2.3 V-ATPase抑制劑27-34
• 1.3 苦皮藤素V作用機理研究進展34-38
• 1.3.1 苦皮藤素V的癥狀學(xué)研究35-36
• 1.3.2 苦皮藤素V對昆蟲部分酶系活性的影響36
• 1.3.3 苦皮藤素V的電生理研究36-37
• 1.3.4 苦皮藤素V選擇性作用機理研究37-38
• 1.4 論文設(shè)計思想38-41
• 1.4.1 選題背景、目的及科學(xué)意義38-39
• 1.4.2 研究內(nèi)容39-40
• 1.4.3 研究技術(shù)路線40-41
• 第二章 結(jié)合蛋白的分離及鑒定41-50
• 2.1 實驗材料41-42
• 2.1.1 試蟲41
• 2.1.2 供試化合物與試劑41
• 2.1.3 主要儀器41-42
• 2.2 實驗方法42-45
• 2.2.1 連接配體的合成42-43
• 2.2.2 基于粘蟲幼蟲中腸刷狀緣膜囊泡（BBMV）的親和層析43-44
• 2.2.3 電泳檢測及結(jié)合蛋白的鑒定44-45
• 2.3 結(jié)果與分析45-47
• 2.3.1 連接配體的合成45
• 2.3.2 結(jié)合蛋白的洗脫45-46
• 2.3.3 電泳檢測與質(zhì)譜鑒定46-47
• 2.4 小結(jié)與討論47-50
• 第三章 二氫沉香呋喃多元酯類化合物對昆蟲V-ATPASE和氨肽酶活性的影響50-61
• 3.1 實驗材料50-52
• 3.1.1 試蟲50
• 3.1.2 供試化合物50-51
• 3.1.3 主要試劑51-52
• 3.1.4 主要儀器52
• 3.1.5 主要緩沖液52
• 3.2 實驗方法52-55
• 3.2.1 二氫沉香呋喃多元酯類化合物的殺蟲活性52-53
• 3.2.2 苦皮藤素V對氨肽酶N（APN）活性的影響53-54
• 3.2.3 二氫沉香呋喃多元酯類化合物對粘蟲中腸V-ATPase活性的影響54-55
• 3.3 結(jié)果與分析55-59
• 3.3.1 二氫沉香呋喃多元酯類化合物的殺蟲活性55-56
• 3.3.2 苦皮藤素V對氨肽酶（APN）活性的影響56-57
• 3.3.3 二氫沉香呋喃多元酯類化合物對粘蟲幼蟲中腸V-ATPase活性影響57-58
• 3.3.4 二氫沉香呋喃多元酯類化合物殺蟲活性與對V-ATPase活性抑制率的相關(guān)性分析58-59
• 3.4 小結(jié)與討論59-61
• 第四章 粘蟲V-ATPASE H亞基全長CDNA克隆和表達分析61-79
• 4.1 實驗材料61-62
• 4.1.1 試蟲61
• 4.1.2 主要試劑61
• 4.1.3 主要儀器61-62
• 4.2 實驗方法62-69
• 4.2.1 粘蟲V-ATPase H亞基全長cDNA的克隆62-68
• 4.2.2 粘蟲V-ATPase H亞基全長cDNA序列的生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建68
• 4.2.3 粘蟲中腸V-ATPase H亞基表達的生長發(fā)育表達特征68-69
• 4.3 結(jié)果與分析69-77
• 4.3.1 粘蟲V-ATPase H亞基cDNA部分基因克隆69-71
• 4.3.2 粘蟲中腸V-ATPase H亞基cDNA的 3′RACE71-73
• 4.3.3 粘蟲中腸V-ATPase H亞基cDNA的 5'RACE73
• 4.3.4 粘蟲V-ATPase H亞基cDNA 3′和 5′RACE的序列驗證73-75
• 4.3.5 序列分析75-76
• 4.3.6 粘蟲中腸V-ATPase H亞基表達的生長發(fā)育表達特征76-77
• 4.4 小結(jié)與討論77-79
• 第五章 二氫沉香呋喃多元酯類化合物和粘蟲V-ATPASE H亞基的結(jié)合親和性分析79-96
• 5.1 實驗材料79-80
• 5.1.1 試蟲79
• 5.1.2 菌株與表達載體79
• 5.1.3 主要試劑79-80
• 5.1.4 主要儀器80
• 5.2 實驗方法80-84
• 5.2.1 粘蟲V-ATPase H亞基的原核表達80-82
• 5.2.2 粘蟲V-ATPase H亞基的純化82
• 5.2.3 二氫沉香呋喃多元酯類化合物和粘蟲V-ATPase H亞基蛋白的結(jié)合親和性與其胃毒活性和V-ATP酶抑制率的相關(guān)性分析82-84
• 5.3 結(jié)果與分析84-95
• 5.3.1 粘蟲V-ATPase H亞基的原核表達與純化84-90
• 5.3.2 二氫沉香呋喃多元酯類化合物和粘蟲V-ATPase H亞基蛋白的結(jié)合親和性與其胃毒活性和對V-ATP酶抑制率的相關(guān)性90-95
• 5.4 小結(jié)與討論95-96
• 第六章 東方粘蟲幼蟲中腸V-ATPASE H亞基同源模建及分子對接96-112
• 6.1 實驗材料96-98
• 6.2 實驗方法98-99
• 6.2.1 粘蟲V-ATPase H亞基模型的構(gòu)建98-99
• 6.2.2 二氫沉香呋喃多元酯類化合物與東方粘蟲幼蟲中腸V-ATPase H亞基的分子對接及結(jié)合位點的預(yù)測99
• 6.3 結(jié)果與分析99-111
• 6.3.1 目的蛋白序列與模板蛋白序列的比對99-100
• 6.3.2 3D模型的構(gòu)建100-101
• 6.3.3 模型評估101-103
• 6.3.4 粘蟲V-ATPase H亞基和二氫沉香呋喃多元酯類化合物活性位點確定及分子對接103-111
• 6.4 小結(jié)與討論111-112
• 第七章 討論與結(jié)論112-119
• 7.1 討論112-116
• 7.1.1 二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲化合物的作用靶標(biāo)112-114
• 7.1.2 二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的結(jié)合位點114
• 7.1.3 二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的作用機理114-116
• 7.2 結(jié)論116-118
• 7.3 論文主要創(chuàng)新點118
• 7.4 尚需研究的問題118-119
• 參考文獻119-131
• 附錄131-135
• 附錄1 化合物譜圖131-133
• 附錄2 緩沖液配制133-134
• 附錄3 縮略詞134-135
• 致謝135-136
• 作者簡介136

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