本文關(guān)鍵詞：塔里木馬鹿（Cervus elaphus yarkandensis）精子體外獲能及其相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：塔里木馬鹿(Cervus elaphus yarkandensis)是我國(guó)特有,唯一能棲息于荒漠景觀中的馬鹿亞種,其在荒漠生物群落中具有重要的生態(tài)地位。近年來(lái),由于開(kāi)發(fā)和經(jīng)濟(jì)活動(dòng)等的影響,導(dǎo)致其棲息地萎縮,種群數(shù)量日益下降,物種生存面臨嚴(yán)重威脅。因此開(kāi)展其繁殖生物學(xué)研究將對(duì)其種群延續(xù)、恢復(fù)具有積極的作用。精子獲能是受精的關(guān)鍵,又是復(fù)雜的生理現(xiàn)象。精子在獲能過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化并受許多因素的調(diào)控,主要的調(diào)控因素包括膽固醇受體白蛋白、碳酸氫鹽、鈣離子和蛋白酪氨酸磷酸化等,其中精子蛋白酪氨酸磷酸化是精子獲能、超激活運(yùn)動(dòng)力的維持以及發(fā)生頂體反應(yīng)等多種生理生化過(guò)程的重要調(diào)控因素。目前,精子獲能及其主要調(diào)控因素的作用機(jī)制尚未完全清楚,鹿類精子高效體外獲能體系尚未實(shí)現(xiàn)。盡管白蛋白、碳酸氫鹽和鈣離子等可以作為體外獲能液的基礎(chǔ)成分,來(lái)研究精子獲能的最初事件,但這三種成分對(duì)精子獲能能力的影響具有物種特異性,而且即使是同一個(gè)物種的研究報(bào)道也存在差異。目前所報(bào)道的鹿類體外受精(IVF)體系中精子穿透率均較低。本研究借助分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生殖生理學(xué)等學(xué)科的技術(shù)手段,以新疆塔里木馬鹿精子為試驗(yàn)材料,從篩選精子體外獲能培養(yǎng)體系入手,研究精子體外獲能及其獲能過(guò)程中的關(guān)鍵分子事件—蛋白酪氨酸磷酸化的發(fā)生及機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上探討分析幾種主要影響或誘導(dǎo)因子對(duì)塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的作用機(jī)理。研究結(jié)果表明：1、鮮精獲能培養(yǎng)前僅檢測(cè)到3條較清晰的酪氨酸磷酸化蛋白條帶,其分子量分別為10 ku、40 ku和47 ku,而獲能培養(yǎng)后發(fā)生酪氨酸磷酸化蛋白條帶增加至7條,其分子量分別為10 ku、14 ku、25 ku、32 ku、40 ku、47 ku和55ku(P0.05)。2、凍精獲能培養(yǎng)前僅檢測(cè)到6條較清晰的酪氨酸磷酸化蛋白,分子量分別為10ku、14 ku、25 ku、40 ku、47 ku和55 ku,而獲能培養(yǎng)后多條蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化,其分子量分別為10 ku、14 ku、25-32 ku、40 ku、47 ku、55 ku和60-85 ku,而且這些蛋白特別是低分子量蛋白的磷酸化水平隨著獲能的進(jìn)行相對(duì)提高,并在獲能培養(yǎng)1-2 h期間相對(duì)較高(P0.05)。3、不同公鹿凍融精子膜蛋白Western blot檢測(cè)到的酪氨酸磷酸化蛋白差異較大,發(fā)生酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的分子量較集中在低分子量蛋白上(分子量為10-85 ku之間),高分子量蛋白(分子量85ku以上)幾乎不發(fā)生酪氨酸磷酸化,不同個(gè)體精子蛋白磷酸化水平之間存在一定的差異(P0.05)。4、哺乳動(dòng)物精子體外獲能常規(guī)方法能促使塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化,其中IA組、肝素組和咖啡因組的精子獲能率及蛋白酪氨酸磷酸化水平均高于對(duì)照組和Percool組(P0.05),并分子量分別為35 ku、40 ku、55 ku蛋白的磷酸化水平相對(duì)提高(P0.05),尤其是肝素組精子獲能率及蛋白酪氨酸磷酸化水平顯著高于其它組(P0.05)。5、塔里木馬鹿精子體外獲能需要BSA、HCO3-及Ca2+的參與。精子體外獲能體系中同時(shí)或單獨(dú)缺少BSA、HCO3-和Ca2+時(shí),精子蛋白酪氨酸磷酸化水平降低,而且這種變化隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)特別顯現(xiàn)出來(lái),相反這三種成分同時(shí)存在的情況下精子蛋白酪氨酸磷酸化水平相對(duì)較高,特別是低分子量蛋白10 ku、18 ku、25-32 ku的變化較為明顯,缺Ca2+和BSA而存在HC03-時(shí)的精子蛋白酪氨酸磷酸化水平與缺HC03-和BSA而存在Ca2+時(shí)的基本相似,但同時(shí)缺少HC03-和Ca2+時(shí)精子蛋白酪氨酸磷酸化水平顯著降低(P0.05)。提示HC03-和Ca2+在塔里木馬鹿精子獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化過(guò)程中具有重要調(diào)控作用,而B(niǎo)SA協(xié)助增強(qiáng)精子獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化過(guò)程。6、BSA有利于塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化,獲能液中添加一定濃度(6-10 mg/mL) BSA能促使塔里木馬鹿精子體外獲能率及其蛋白酪氨酸磷酸化水平并與低濃度3 mg/mL組相比差異顯著(P0.05),特別是分子量為55 ku酪氨酸磷酸化蛋白的表達(dá)水平明顯提高(P0.05),但6 mg/mL組與10 mg/mL之間無(wú)顯著性差異(P0.05),表明BSA最佳使用量為6 mg/mL。7、一定濃度的HC03-有利于塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化,缺少HC03-或濃度較低時(shí),精子活力、精子獲能率下降(P0.05)；HC03-濃度15-25mM時(shí)精子獲能率最高,但HC03-濃度提高至37 mM時(shí)反而頂體反應(yīng)率升高,且均表現(xiàn)出時(shí)間依賴性升高(P0.05)。另外,低濃度HC03-條件下酪氨酸磷酸化蛋白的表達(dá)水平較低,而濃度提高到15 mM后分子量40-56 ku蛋白的磷酸化水平相對(duì)提高,且呈時(shí)間依賴性上調(diào)(P0.05)。表明HCO3-最佳使用濃度為25 mM。8、一定濃度的Ca2+有利于塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化,低濃度(0-2.2 mM) Ca2+的各組精子活力基本相同,但高濃度(3.5-5.0 mM) Ca2+明顯抑制了精子活力(P0.05),促進(jìn)了精子提早發(fā)生頂體反應(yīng)(P0.05)；另外,Ca2+濃度越高,發(fā)生酪氨酸磷酸化蛋白的表達(dá)水平越低,1.1 mM組相對(duì)優(yōu)于其它組(P0.05),表明Ca2+最佳使用濃度為1.1 mM。9、在塔里木馬鹿精子體外獲能體系中添加血清有利于獲得更好的獲能效果,分別添加發(fā)情羊血清(ESS),非發(fā)情羊血清(NSS)和發(fā)情鹿血清(EDS)的結(jié)果中ESS誘發(fā)的獲能精子比例最高,分子量55 ku蛋白的酪氨酸磷酸化水平顯著提高(P0.05),表明發(fā)情羊血清比發(fā)情鹿血清更有效(P0.05)。10、獲能體系中發(fā)情羊血清存在時(shí)無(wú)需添加BSA,發(fā)情羊血清與肝素結(jié)合使用的效果明顯優(yōu)于BSA與肝素結(jié)合使用。發(fā)情羊血清與肝素結(jié)合使用不僅明顯提高了部分低分子量蛋白(10±2ku,14±2ku,25±3 ku和47±3 ku)的磷酸化水平,而且還提高了部分高分子量蛋白(70-110 ku)的酪氨酸磷酸化水平(P0.05)。11、所篩選的塔里木馬鹿精子體外獲能培養(yǎng)適宜體系為：使用修正后的TALP基礎(chǔ)液,添加6 mg/mL BSA,洗精、采用上游法收集高活力精子后,以ESS(20%)與肝素(20μg/mL)誘導(dǎo)獲能4 h,培養(yǎng)條件為5%C02,38.5℃,飽和濕度。經(jīng)比較,應(yīng)用該體系可顯著提高分子量分別為10 ku、14 ku、25～32 ku、40 ku、47～55 ku、70～110ku等10余種蛋白的磷酸化水平(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：塔里木馬鹿(Cervus elaphus yarkandensis) 精子 體外獲能 蛋白酪氨酸磷酸化
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S825
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-18
• 1 緒論18-26
• 1.1 選題背景18-19
• 1.2 文獻(xiàn)綜述19-25
• 1.2.1 精子在受精前的活化過(guò)程19
• 1.2.2 精子獲能的調(diào)控機(jī)制及獲能相關(guān)的主要因素19-21
• 1.2.3 精子蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化21-22
• 1.2.4 精子蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑22-23
• 1.2.5 影響精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的主要因素23-24
• 1.2.6 鹿類精子體外獲能及其相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化研究概況24-25
• 1.3 研究目的、內(nèi)容及意義25-26
• 2 材料與方法26-37
• 2.1 試驗(yàn)動(dòng)物,精液采集與冷凍保存26
• 2.2 動(dòng)物血清的制備26-27
• 2.3 主要儀器設(shè)備27
• 2.4 主要試劑,抗體及藥品27-28
• 2.5 培養(yǎng)液及處理液28-29
• 2.6 精子體外獲能及其檢測(cè)29-31
• 2.6.1 精子處理方法29
• 2.6.2 誘導(dǎo)精子體外獲能的方法29-30
• 2.6.3 精子質(zhì)量檢測(cè)和獲能水平的評(píng)價(jià)30-31
• 2.7 精子膜蛋白酪氨酸磷酸化檢測(cè)(Western blotting)31-34
• 2.7.1 精子膜蛋白的提取31-32
• 2.7.2 精子膜蛋白的SDS-PAGE電泳32-33
• 2.7.3 精子酪氨酸磷酸化蛋白的檢測(cè)33-34
• 2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析34-35
• 2.9 研究?jī)?nèi)容及試驗(yàn)設(shè)計(jì)35-37
• 2.9.1 對(duì)比塔里木馬鹿鮮精與凍精體外獲能及酪氨酸磷酸化蛋白的差異表達(dá)35
• 2.9.2 對(duì)比不同個(gè)體凍融精子酪氨酸磷酸化蛋白的差異表達(dá)35
• 2.9.3 篩選最適宜塔里木馬鹿精子處理方法35
• 2.9.4 篩選最適宜塔里木馬鹿精子體外獲能培養(yǎng)液35
• 2.9.5 篩選最適宜塔里木馬鹿精子體外獲能方法35
• 2.9.6 塔里木馬鹿精子體外獲能與培養(yǎng)基中基礎(chǔ)成分Ca~(2+)、HCO_3~-及BSA的必要性及其協(xié)同作用的探討35-36
• 2.9.7 篩選精子獲能培養(yǎng)基中基礎(chǔ)成分Ca~(2+)、HCO_3~-及BSA的適宜濃度36
• 2.9.8 對(duì)比不同血清對(duì)塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化水平的影響36
• 2.9.9 對(duì)比探討血清和BSA與肝素結(jié)合使用對(duì)塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影響36
• 2.9.10 塔里木馬鹿精子體外獲能最佳培養(yǎng)體系的篩選及其驗(yàn)證36-37
• 3 試驗(yàn)結(jié)果37-80
• 3.1 塔里木馬鹿精子的CTC染色分類37
• 3.2 塔里木馬鹿鮮精和凍精體外獲能及蛋白酪氨酸磷酸化的比較37-41
• 3.2.1 鮮精和凍精活力及存活時(shí)間的比較37-38
• 3.2.2 鮮精和凍精體外獲能率的比較38-39
• 3.2.3 鮮精和凍精頂體反應(yīng)率的比較39
• 3.2.4 鮮精和凍精酪氨酸磷酸化蛋白的差異表達(dá)39-41
• 3.3 塔里木馬鹿不同個(gè)體凍融精子酪氨酸磷酸化蛋白的差異表達(dá)41-42
• 3.4 凍精不同處理方法對(duì)塔里木馬鹿活動(dòng)精子回收率及體外獲能效果的影響42-46
• 3.4.1 凍精不同處理方法對(duì)活動(dòng)精子回收率的影響42-43
• 3.4.2 凍精不同處理方法對(duì)精子活力及其存活時(shí)間的影響43-44
• 3.4.3 凍精不同處理方法對(duì)精子體外獲能效果的影響44-46
• 3.5 不同培養(yǎng)液對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能效果的影響46-48
• 3.5.1 不同培養(yǎng)液對(duì)精子活力及存活時(shí)間的影響46-47
• 3.5.2 不同培養(yǎng)液對(duì)精子體外獲能效果的影響47-48
• 3.6 不同獲能方法對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及蛋白酪氨酸磷酸化的影響48-50
• 3.6.1 不同獲能方法對(duì)精子體外獲能效果的影響48-49
• 3.6.2 不同獲能方法對(duì)凍融塔里木馬鹿精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的影響49-50
• 3.7 BSA、HCO_3~-和Ca~(2+)對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及蛋白酪氨酸磷酸化的影響50-66
• 3.7.1 BSA、HCO_3~-和Ca~(2+)協(xié)同對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及蛋白酪氨酸磷酸化的影響50-54
• 3.7.2 BSA對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化水平的影響54-58
• 3.7.3 HCO_3~-對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及蛋白酪氨酸磷酸化的影響58-62
• 3.7.4 Ca~(2+)對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及蛋白酪氨酸磷酸化的影響62-66
• 3.8 血清與肝素結(jié)合使用對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影響66-74
• 3.8.1 不同血清對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及蛋白酪氨酸磷酸化水平的影響66-70
• 3.8.2 發(fā)情羊血清(ESS)和BSA與肝素(Hep)交叉使用對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影響70-74
• 3.9 塔里木馬鹿精子體外獲能最佳培養(yǎng)體系的驗(yàn)證74-80
• 3.9.1 3種精子體外獲能體系的比較74-77
• 3.9.2 塔里木馬鹿精子體外獲能體系的驗(yàn)證77-80
• 4 分析與討論80-89
• 4.1 塔里木馬鹿鮮精與凍精獲能過(guò)程中精子活力、獲能率、頂體反應(yīng)率的變化80
• 4.2 塔里木馬鹿鮮精與凍精獲能過(guò)程中酪氨酸磷酸化蛋白的變化80-81
• 4.3 塔里木馬鹿不同個(gè)體凍融精子蛋白酪氨酸磷酸化表達(dá)水平的比較81-82
• 4.4 凍精不同處理方法對(duì)塔里木馬鹿活動(dòng)精子回收率及體外獲能效果的影響82
• 4.5 不同培養(yǎng)液對(duì)塔里木馬鹿凍融精子體外獲能效果的影響82-83
• 4.6 不同獲能方法對(duì)塔里木馬鹿精子體外獲能效果及蛋白酪氨酸磷酸化的影響83-84
• 4.7 BSA、HCO_3~-和Ca~(2+)協(xié)同對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影響84-85
• 4.8 BSA對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影響85
• 4.9 碳酸根離子(HCO_3~)對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影響85-86
• 4.10 鈣離子(Ca~(2+))對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影響86-87
• 4.11 血清和肝素協(xié)同對(duì)凍融塔里木馬鹿精子體外獲能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影響87-89
• 結(jié)論89-90
• 參考文獻(xiàn)90-101
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文101-102
• 致謝102-103

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