本文關(guān)鍵詞：靶向樹突狀細胞通用型禽流感病毒重組乳酸菌的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一種非常重要的傳染病。它不僅能對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失,而且也嚴重威脅著人類的健康。目前為止,疫苗是控制抗禽流感最為有效的手段。目前,商品化滅活疫苗雖然可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體來控制禽流感病毒的感染,但由于禽流感病毒亞型和基因的不斷變異,基于AIV表面蛋白的疫苗僅能提供有限的保護。因此,研發(fā)能誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)抵抗不同亞型AIV的疫苗一直是個熱點問題。禽流感病毒的核蛋白(nucleo-protein,NP)和基質(zhì)蛋白(matrix protein,M1)不僅在不同亞型AIV間高度保守,還具有誘導(dǎo)細胞免疫的能力。它們是開發(fā)具有廣泛保護作用的通用型疫苗的候選抗原。本文以禽流感病毒保守蛋白NP和M1通用型疫苗為研究對象,首先,從禽流感病毒A/duck/Xuzhou/07/2003(H9N2)中對其NP基因進行擴增、克隆和測序分析;利用分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建能夠融合表達H9N2亞型禽流感病毒NP基因、M1基因和樹突狀細胞誘導(dǎo)肽(DCpep)基因的原核表達載體;以植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,NC8)作為表達外源基因的載體,構(gòu)建重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep;使用免疫印跡方法驗證融合基因在乳酸菌中的表達情況。結(jié)果顯示,克隆了A/duck/Xuzhou/07/2003(H9N2)毒株的NP全長,長度為1494 bp。構(gòu)建了能融合表達該毒株NP和M1蛋白的重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep。此株重組乳酸菌表達的83 kDa融合蛋白對H9N2亞型禽流感NP單克隆抗體有良好的反應(yīng)原性。其次,使用重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep與小鼠骨髓源DC共培養(yǎng),利用流式細胞儀和ELISA方法檢測DC表面的活化標志和細胞因子的表達水平;重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep口服免疫小鼠后,用流式細胞術(shù)分別檢測小鼠PP、MLN和小腸DC的表面標志,MLN和脾臟特異性CD4+IFN-γ+或CD8+IFN-γ+的表達水平以及PP中B細胞分泌IgA和活化情況。結(jié)果表明重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep在體外能誘導(dǎo)小鼠骨髓源DC的B7分子活化,在體內(nèi)能誘導(dǎo)小鼠PP和小腸DC活化。此外,口服免疫重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep,不僅能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性T細胞反應(yīng),還能誘導(dǎo)小鼠小腸B細胞活化,促進了PP中生發(fā)中心的形成,增強sIgA的分泌能力。進而,應(yīng)用重組乳酸菌口服免疫小鼠,使用鼠適應(yīng)性同源禽流感病毒A/duck/Xuzhou/07/2003(H9N2)和異源流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)進行攻毒保護實驗。結(jié)果顯示,重組乳酸菌對感染同源禽流感病毒的小鼠能產(chǎn)生80%的保護率,對感染10×LD50 H1N1流感病毒的小鼠不能產(chǎn)生保護,但對感染0.5×LD50 H1N1流感病毒的小鼠能產(chǎn)生完全的保護作用。最后,為探索重組乳酸菌發(fā)揮抗禽流感病毒的作用機制,應(yīng)用重組乳酸菌口服免疫小鼠,加強免疫2周后,取一部分小鼠脾臟單細胞用CFSE染色,特異性抗原刺激3d后,流式細胞儀檢測小鼠脾臟CD4+和CD8+T細胞的增殖情況;取另一部分小鼠脾臟單細胞用流式細胞術(shù)檢測CD8+CD107a+的表達水平。先用不同濃度CFSE對未免疫小鼠脾臟單細胞進行染色,然后用特異性抗原刺激脾臟細胞3 h,通過尾靜脈方式回輸給口服重組乳酸菌免疫后的小鼠,18 h后流式細胞術(shù)檢測免疫后小鼠的脾細胞特異性殺傷能力�；谝陨蠈嶒灲Y(jié)果,用免疫磁珠分選口服重組乳酸菌的BALB/c小鼠脾臟CD4+和CD8+T細胞,通過尾靜脈回輸NOD-SCID缺陷小鼠,12 h后感染同源禽流感病毒mH9N2,驗證口服免疫后小鼠的T細胞亞群對NOD-SCID缺陷小鼠的保護作用。結(jié)果顯示,重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep能顯著誘導(dǎo)免疫后小鼠脾臟特異性CD4+和CD8+T細胞增殖能力、CD8+CD107a+的表達水平以及脾細胞殺傷能力�；剌擭OD-SCID缺陷小鼠發(fā)現(xiàn),重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep免疫的小鼠CD4+T細胞和CD4+T細胞與CD8+T細胞聯(lián)合(1:1混合)都不能為禽流感病毒感染的NOD-SCID小鼠提供保護,但是CD8+T細胞具有較好的保護作用,能有效的延長小鼠存活時間。本實驗構(gòu)建了基于禽流感病毒NP、M1和樹突狀細胞誘導(dǎo)肽基因的重組乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep。它能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性T細胞免疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng),能對同型鼠適應(yīng)性禽流感病毒和異源流感病毒產(chǎn)生部分保護作用。通過NOD-SCID缺陷小鼠進一步證實口服重組乳酸菌誘導(dǎo)CD8+T細胞在抗禽流感病毒感染中發(fā)揮重要作用。這為研究通用型口服重組乳酸菌活載體疫苗的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：禽流感 植物乳桿菌 樹突狀細胞 核蛋白 基質(zhì)蛋白 黏膜免疫 口服疫苗
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 前言11-13
• 第一篇 文獻綜述13-33
• 第一章 禽流感研究進展13-25
• 1.1 禽流感病原特征13-16
• 1.2 禽流感的流行現(xiàn)狀16-18
• 1.3 流感病毒感染誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答18-23
• 1.4 基于NP和M1的通用型流感疫苗的研究進展23-25
• 第二章 口服疫苗的攝取途徑和遞送系統(tǒng)25-27
• 2.1 靶向上皮受體增強口服疫苗傳遞25
• 2.2 攝取抗原途徑25-26
• 2.3 口服抗原傳遞系統(tǒng)26-27
• 第三章 乳酸菌作為口服遞送載體的研究進展27-31
• 3.1 乳酸菌作為黏膜疫苗載體的特性27-28
• 3.2 乳酸球菌作為黏膜疫苗遞送載體的應(yīng)用28-29
• 3.3 乳酸桿菌屬作為黏膜疫苗遞送載體的應(yīng)用29-31
• 第四章 樹突狀細胞的研究進展31-33
• 第二篇 研究內(nèi)容33-107
• 第一章 表達NP-M1-DCPEP重組乳酸菌的構(gòu)建及驗證33-58
• 1.1 材料與方法33-47
• 1.2 結(jié)果47-56
• 1.3 討論56-57
• 1.4 小結(jié)57-58
• 第二章 重組乳酸菌對小鼠免疫功能的影響58-82
• 2.1 材料與方法58-62
• 2.2 結(jié)果62-80
• 2.3 討論80-81
• 2.4 小結(jié)81-82
• 第三章 重組乳酸菌對小鼠的保護作用研究82-95
• 3.1 材料與方法82-85
• 3.2 結(jié)果85-93
• 3.3 討論93-94
• 3.4 小結(jié)94-95
• 第四章 重組乳酸菌對禽流感病毒的保護機制初探95-107
• 4.1 材料與方法95-98
• 4.2 結(jié)果98-106
• 4.3 討論106
• 4.4 小結(jié)106-107
• 結(jié)論107-108
• 參考文獻108-121
• 英文縮略表121-123
• 作者簡介123-125
• 致謝125-126

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Masoud Soltanialvar;Reza Goodarzi;Farshad Akbarnejad;;Genetic analysis of polymerase complex(PA,PB1 and PB2) genes of H9N2 avian influenza viruses from Iran(1999 to 2009)[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2012年11期

2 朱云;史景紅;舒躍龍;;野禽禽流感病毒監(jiān)測概述[J];病毒學(xué)報;2014年03期

3 李海琴;傅光華;黃瑜;韋啟鵬;唐維國;;H5、H9亞型禽流感病毒及鴨坦布蘇病毒多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報;2015年08期

4 徐德忠;張揚;王波;唐曉鳳;張景霞;孫慧敏;張磊;陳長生;;人感染H7N9禽流感分布異常及其異常起源之可能[J];中華疾病控制雜志;2013年08期

5 吳曉旭;田懷玉;周森;陳麗凡;徐冰;;全球變化對人類傳染病發(fā)生與傳播的影響[J];中國科學(xué):地球科學(xué);2013年11期

6 WU XiaoXu;TIAN HuaiYu;ZHOU Sen;CHEN LiFan;XU Bing;;Impact of global change on transmission of human infectious diseases[J];Science China(Earth Sciences);2014年02期

7 王惠明;顏奇;丁國華;;支架蛋白JLP對樹突狀細胞CD40分子跨膜穿梭轉(zhuǎn)運的調(diào)控作用[J];武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年01期

8 于建寧;宋小敬;王公金;潘偉芹;徐小波;于峰祥;李燕;;乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年08期

9 閆章才;薛麗香;李國才;高福;董爾丹;;流行性感冒防控基礎(chǔ)研究狀況及關(guān)鍵科學(xué)問題分析[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2014年01期

10 齊浩;侯喜林;王桂華;余麗蕓;徐超;;大腸桿菌ETEC 987P菌毛蛋白重組干酪乳桿菌的構(gòu)建[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張坤;豚鼠抗流感病毒相關(guān)因子研究及H9N2亞型禽流感病毒致病力分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 王志勝;表達H5N1血凝素HAl重組乳酸菌的構(gòu)建及其免疫效力的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 張濤;肺形草抗H5N1禽流感活性成分研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2013年

4 孫軍峰;IBV，NDV，，AIV H9感染雞氣管比較蛋白質(zhì)組分析及雞galectin CG-1B在NDV感染中作用機制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

5 尹海龍;茄屬中草藥天茄籽和白英抗H5N1病毒活性成分研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2013年

6 鄧幼平;大青葉提取物抗呼吸道病毒作用的藥效學(xué)研究[D];武漢大學(xué);2013年

7 李莉;T病毒RNA在Hela細胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制并誘導(dǎo)細胞凋亡的相關(guān)途徑研究[D];武漢大學(xué);2011年

8 朱云;東洞庭湖地區(qū)野禽、家禽和人感染禽流感病毒的調(diào)查研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2014年

9 張偉;1999年～2013年山東雞源H9N2亞型禽流感病毒遺傳演化和血凝素抗原性研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 孔維立;歐洲類禽H1N1豬流感病毒與H1N1/2009病毒豬體內(nèi)重排病毒的鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊蜜蜜;自身免疫性肝炎小鼠腹腔巨噬細胞功能改變及其在治療中的作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

2 熊正慧;我國某地H5亞型禽流感分子流行病學(xué)調(diào)查及變異分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 劉彥云;H5和H9亞型禽流感病毒遺傳特性分析及細胞培養(yǎng)候選疫苗株的拯救[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

4 陳光;野鳥源H5N2亞型禽流感病毒的分子克隆及遺傳進化分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2013年

5 張鑫淼;減毒沙門氏菌遞呈的TGEV S/N雙基因疫苗的口服免疫誘導(dǎo)規(guī)律研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 劉

本文編號：382287