發(fā)布時(shí)間：2017-05-20 09:01

  本文關(guān)鍵詞：柑橘綠霉病菌比較基因組及抗DMI殺菌劑機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：我國(guó)是世界上柑橘種植和消費(fèi)的主要大國(guó)之一,柑橘年產(chǎn)量超過千萬噸。柑橘綠霉病一直以來是困擾柑橘儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)的主要問題。在我國(guó),每年因綠霉病導(dǎo)致的柑橘產(chǎn)量損失高達(dá)百萬噸。目前對(duì)柑橘綠霉病的防治手段捉襟見肘,病菌抗藥性產(chǎn)生的速率遠(yuǎn)超藥劑更替的速率,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全帶造成了嚴(yán)重的威脅。然而,由于對(duì)病菌的侵染過程和殺菌劑作用機(jī)理缺乏足夠的認(rèn)識(shí),如何有效提高病害的防治效果,同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的傷害是我們目前所面臨的重大挑戰(zhàn)。本研究在此背景下,通過對(duì)柑橘綠霉病菌的全基因組測(cè)序,系統(tǒng)了解了病菌的遺傳組成,同時(shí)在獲得基因組信息的基礎(chǔ)上,闡明了我國(guó)柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑主要菌群的抗性調(diào)控機(jī)理。研究結(jié)果如下： 1.柑橘綠霉病菌基因組測(cè)序揭示大量次生代謝及細(xì)胞壁水解酶等基因家族的丟失 通過全基因組測(cè)序,我們獲得了約26Mb的柑橘綠霉病菌基因組序列,包含103個(gè)scaffold。該基因組共編碼約9,000個(gè)蛋白和162個(gè)tRNA。重復(fù)序列約占整個(gè)基因組的1%。通過與其他青霉菌、曲霉菌以及近緣的植物病原真菌比較分析后發(fā)現(xiàn),柑橘綠霉病菌基因組更為緊湊,編碼相對(duì)較少的基因�；蚪M共線性和蛋白家族進(jìn)化分析顯示,柑橘綠霉病菌有100多個(gè)家族發(fā)生了明顯的縮減,僅有兩個(gè)家族發(fā)生了擴(kuò)增。通過對(duì)次生代謝物合成基因簇的預(yù)測(cè),我們發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中丟失了大部分毒素合成基因簇的關(guān)鍵合成基因,僅保留了一個(gè)完整的tryptoquialanine合成基因簇,這一結(jié)果解釋了前人研究發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌毒素合成能力較弱的現(xiàn)象,同時(shí)也預(yù)示毒素跟病菌的致病能力并不相關(guān)。通過碳?xì)浠衔锎x相關(guān)酶的比較發(fā)現(xiàn),柑橘綠霉病菌丟失了大量的細(xì)胞壁水解酶,這也可能是導(dǎo)致該病菌寄主范圍較窄的原因之一。 2.線粒體基因組比較分析顯示柑橘綠霉病菌在進(jìn)化過程了丟失了內(nèi)含子 通過基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的拼接和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,我們得到了柑橘綠霉病菌的全長(zhǎng)線粒體基因組,該線粒體基因組大小為28,978bp,平均A+T含量為74.7%,共編碼15個(gè)蛋白,27個(gè)tRNA,以及兩個(gè)核糖體大、小亞基RNA基因。與酵母等物種相比,青霉屬真菌線粒體基因組雖然編碼能力(編碼基因數(shù))大致相當(dāng),但其編碼效率較高(80%為編碼序列)。青霉菌和曲霉菌的線粒體基因組比較分析發(fā)現(xiàn),這些菌中線粒體基因組的序列和編碼基因的排列都比較保守,其中atp8基因可能受到負(fù)選擇作用。此外,線粒體內(nèi)含子在所比較的幾個(gè)真菌中差異相對(duì)較大,而柑橘綠霉病菌在進(jìn)化過程中可能丟失了一些內(nèi)含子。 3.比較轉(zhuǎn)錄組揭示柑橘綠霉病菌在碳源利用及PacC調(diào)控基因方面的差異 通過對(duì)柑橘綠霉病菌在柑橘皮和葡萄糖培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄組分析,我們發(fā)現(xiàn)在柑橘皮培養(yǎng)基上有290個(gè)基因發(fā)生了上調(diào)表達(dá),而123個(gè)基因發(fā)生了下調(diào)表達(dá)。使用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋后發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與一些代謝過程。此外,很多參與碳源利用的基因都發(fā)生了上調(diào),如木酮糖還原酶,翻轉(zhuǎn)酶,幾丁質(zhì)酶,和β-N乙酰已糖胺酶等。相反,參與氨基酸、核苷酸代謝的這些基因大多都沒有發(fā)生差異表達(dá)。另外,部分細(xì)胞壁水解酶以及tryptoquialanine的整個(gè)合成基因都發(fā)生了上調(diào)表達(dá)。 柑橘綠霉病菌和膠孢炭疽菌都能夠侵染柑橘果實(shí),然而兩者采取截然不同的策略,前者在侵染的時(shí)候能夠產(chǎn)生有機(jī)酸使環(huán)境酸化,而后者則分泌胺類物質(zhì)使環(huán)境堿化。通過對(duì)這兩個(gè)真菌中PacC突變體的表達(dá)譜分析后發(fā)現(xiàn),產(chǎn)酸和產(chǎn)堿真菌中PacC的調(diào)控機(jī)理已經(jīng)發(fā)生了較為明顯的分化,盡管識(shí)別的模體和調(diào)控的基因家族相對(duì)保守,但是對(duì)于特定基因的調(diào)控方式(上調(diào)或下調(diào))以及表達(dá)量差異明顯,產(chǎn)堿真菌中盡管被抑制的基因和被激活的基因數(shù)目相當(dāng),但是堿性表達(dá)基因在PacC激活情況下表達(dá)量有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。而產(chǎn)酸真菌中,大量的基因在堿性條件下被抑制表達(dá),但當(dāng)病菌生長(zhǎng)過程中,環(huán)境pH不斷降低,這些基因?qū)㈥懤m(xù)被激活,從而參與生長(zhǎng)和致病過程。 4. PdCYP51B基因的超量表達(dá)是造成柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑的原因 在2000年到2010年期間,我們?cè)谡憬≈饕涕佼a(chǎn)區(qū)收集了403個(gè)柑橘綠霉病菌菌株,其中,高達(dá)89%的抗性菌株其抗性機(jī)理不明。為此,我們比較了不同的抗性和敏感菌株,發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中存在另外兩個(gè)相似度較高的CYP51基因,稱之為PdCYP51B和PdCYP51C。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在未知抗性菌株中,PdCYP51B啟動(dòng)子區(qū)都含有一段199bp序列的插入,這個(gè)特征在抑霉唑敏感菌株和已知抗性基因型的菌株中均不存在。將敏感菌株中的PdCYP51B基因轉(zhuǎn)入柑橘綠霉病菌后,突變體的抗藥性增加,而將含有199bp序列插入的PdCYP51B基因轉(zhuǎn)入病菌后,突變體的抗藥性增加更高。說明,199bp序列的插入造成了PdCYP51B基因的超量表達(dá),從而賦予了病菌對(duì)藥劑的抗性。 5.199bp插入片段是一個(gè)具有轉(zhuǎn)座和啟動(dòng)子活性的微小轉(zhuǎn)座子 對(duì)上述199bp插入片段進(jìn)行序列分析,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)TSD (target site duplication)和一個(gè)TIR (terminal invert repeat)位點(diǎn)。此外,該序列無編碼能力,能夠形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu),且富含A+T�；谝陨戏治�,我們認(rèn)為該199bp屬于微小轉(zhuǎn)座子家族(miniature inverted-repeat transposable element, MITE),命名為PdMLEl。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和Southern雜交顯示,PdMLEl僅存在于柑橘綠霉病菌中,且拷貝數(shù)較多。GFP融合表達(dá)顯示,PdMLEl能夠啟動(dòng)GFP表達(dá),且啟動(dòng)子能力較強(qiáng)。通過對(duì)PdMLEl核心啟動(dòng)子序列定位,我們得到了一段20bp的啟動(dòng)子核心區(qū)域,同時(shí)我們也通過類似的方法獲得了PdCYP51B基因原始啟動(dòng)子的核心區(qū)域,綜合以上信息,我們提出了一個(gè)轉(zhuǎn)座子影響病菌抗藥性的調(diào)控模型。 以上五部分內(nèi)容的研究相輔相成,不僅揭示了柑橘綠霉病菌抗藥性的產(chǎn)生和調(diào)控機(jī)理,同時(shí)更多的是揭示了柑橘綠霉病菌的基因組遺傳信息,給后續(xù)深入理解病菌其他方面的分子機(jī)理提供了研究基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：柑橘綠霉病菌 基因組測(cè)序 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 抗藥性 植物病原真菌 轉(zhuǎn)座子 調(diào)控模型
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S436.66
【目錄】：

• 致謝7-11
• 摘要11-14
• Abstract14-18
• 第一章 緒論18-31
• 1.1 課題背景18-19
• 1.2 病原真菌侵染果實(shí)過程和互作機(jī)制19-24
• 1.2.1 病原真菌侵染和定殖的過程19-20
• 1.2.2 果皮對(duì)真菌侵染和定殖的影響20-21
• 1.2.3 果實(shí)防衛(wèi)反應(yīng)的影響21-22
• 1.2.4 有關(guān)果實(shí)病原真菌致病機(jī)制的研究22-24
• 1.3 柑橘綠霉病化學(xué)防治及病菌抗藥性研究24-29
• 1.3.1 DMI殺菌劑的作用機(jī)理25
• 1.3.2 DMI殺菌劑抗性產(chǎn)生及其機(jī)理25-27
• 1.3.3 靶標(biāo)基因上調(diào)表達(dá)機(jī)理27-28
• 1.3.4 柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑新型分子機(jī)理28-29
• 1.4 高通量測(cè)序在揭示病菌致病機(jī)理中的應(yīng)用29-30
• 1.5 本研究的目的和意義30-31
• 第二章 柑橘綠霉病菌基因組測(cè)序和比較基因組分析31-51
• 2.1 引言31
• 2.2 材料和方法31-34
• 2.2.1 菌株及培養(yǎng)條件31-32
• 2.2.2 DNA提取及基因組測(cè)序、組裝32
• 2.2.3 基因預(yù)測(cè)及注釋32-33
• 2.2.4 基因組共線性、直系同源基因和進(jìn)化分析33
• 2.2.5 蛋白家族分類與進(jìn)化分析33
• 2.2.6 分泌蛋白預(yù)測(cè)33-34
• 2.2.7 次級(jí)代謝物合成基因簇預(yù)測(cè)34
• 2.2.8 在線數(shù)據(jù)34
• 2.3 結(jié)果與討論34-49
• 2.3.1 柑橘綠霉病菌形態(tài)及侵染循環(huán)34-35
• 2.3.2 柑橘綠霉病菌基因組特征35-37
• 2.3.3 青霉屬直系同源基因比較37-40
• 2.3.4 柑橘綠霉病菌與其他真菌基因組共線性比較40-41
• 2.3.5 柑橘綠霉病菌致病相關(guān)基因41-43
• 2.3.6 柑橘綠霉病菌細(xì)胞壁水解酶43-46
• 2.3.7 柑橘綠霉病菌毒素合成46-47
• 2.3.8 柑橘綠霉病菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白47-49
• 2.4 本章小結(jié)49-51
• 第三章 柑橘綠霉病菌線粒體基因組51-59
• 3.1 引言51
• 3.2 材料與方法51-52
• 3.2.1 菌株、培養(yǎng)條件、基因組測(cè)序51-52
• 3.2.2 生物信息學(xué)分析52
• 3.3 結(jié)果與討論52-57
• 3.3.1 線粒體基因特征52
• 3.3.2 線粒體蛋白編碼基因52-55
• 3.3.3 線粒體內(nèi)含子及內(nèi)含子基因55-57
• 3.3.4 線粒體tRNA基因57
• 3.3.5 線粒體rRNA基因57
• 3.4 本章小結(jié)57-59
• 第四章 柑橘綠霉病菌比較轉(zhuǎn)錄組研究59-73
• 4.1 引言59-60
• 4.2 材料與方法60-61
• 4.2.1 菌株與培養(yǎng)條件60
• 4.2.2 文庫(kù)制備和數(shù)據(jù)分析60-61
• 4.3 結(jié)果與討論61-70
• 4.3.1 不同培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄組差異61-66
• 4.3.2 不同真菌之間PacC調(diào)控差異66-70
• 4.4 本章小結(jié)70-73
• 第五章 柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑新基因型的發(fā)現(xiàn)73-92
• 5.1 引言73
• 5.2 材料與方法73-80
• 5.2.1 菌株、材料及培養(yǎng)方法73-74
• 5.2.2 培養(yǎng)基74-75
• 5.2.3 試劑75-76
• 5.2.4 引物序列76-77
• 5.2.5 抑霉唑抗性表型和基因型檢測(cè)77
• 5.2.6 PdCYP51B和PdCYP51C基因的克隆和序列分析77
• 5.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR77-78
• 5.2.8 過表達(dá)載體構(gòu)建78
• 5.2.9 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化78-79
• 5.2.10 Southern雜交79-80
• 5.2.11 PCR方法檢測(cè)柑橘綠霉病菌抗性基因型80
• 5.3 結(jié)果與討論80-89
• 5.3.1 柑橘綠霉病菌對(duì)抑霉唑抗性及抗性基因型80-81
• 5.3.2 CYP51同源基因的克隆81-82
• 5.3.3 PdCYP51B啟動(dòng)子區(qū)含有199bp序列插入82-84
• 5.3.4 199bp插入序列的生物信息學(xué)分析84
• 5.3.5 PdCYP51B基因在IMZ-R3菌株中超量表達(dá)84-85
• 5.3.6 PdCYP51同源基因均能被抑霉唑誘導(dǎo)85-86
• 5.3.7 過表達(dá)PdCYP51B基因降低病菌對(duì)抑霉唑的敏感性86-87
• 5.3.8 基于雙重PCR的DMI抗性基因型檢測(cè)87-89
• 5.4 本章小結(jié)89-92
• 第六章 柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑新基因型的調(diào)控機(jī)理92-103
• 6.1 引言92-93
• 6.2 材料與方法93-94
• 6.2.1 菌株和培養(yǎng)方法93
• 6.2.2 載體構(gòu)建93
• 6.2.3 啟動(dòng)子定位93-94
• 6.2.4 Southern雜交94
• 6.2.5 生物信息學(xué)分析94
• 6.3 結(jié)果與討論94-101
• 6.3.1 199bp插入序列是一個(gè)轉(zhuǎn)座子94-95
• 6.3.2 PdMLE1特異且廣泛的存在于柑橘綠霉病菌中95-96
• 6.3.3 PdMLE1是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子96-97
• 6.3.4 PdMLE1和PdCYP51B核心啟動(dòng)子區(qū)定位97-99
• 6.3.5 PdMLE1的全基因組插入位點(diǎn)分析99-101
• 6.4 本章小結(jié)101-103
• 第七章 全文總結(jié)103-107
• 7.1 柑橘綠霉病菌基因組測(cè)序及比較基因組研究103-104
• 7.2 柑橘綠霉病菌抗藥性研究104-105
• 7.3 全文創(chuàng)新點(diǎn)105-106
• 7.4 全文不足之處106
• 7.5 今后的研究方向106-107
• 參考文獻(xiàn)107-119
• 附錄119-127
• 研究生期間發(fā)表論文127-128

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：柑橘綠霉病菌比較基因組及抗DMI殺菌劑機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：381130