T-2毒素是由鐮刀菌(Fusarium)產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物,也是A類單端孢霉烯族毒素中毒性最強(qiáng)的一種。T-2毒素在自然界中分布非常廣泛,在田間生長的作物如大麥、小麥、燕麥、黑麥和玉米,以及儲(chǔ)存的谷物都是T-2毒素的污染對(duì)象。動(dòng)物在攝入污染了T-2毒素的飼料后能引起多種毒性作用,腸道和肝臟對(duì)T-2毒素尤其敏感。T-2毒素能夠降低動(dòng)物的食欲和增重,引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。T-2毒素還可能通過食物鏈進(jìn)入人們的餐桌,因此對(duì)動(dòng)物和食品動(dòng)物消費(fèi)者的健康都具有較大的威脅。T-2毒素對(duì)食品動(dòng)物的一個(gè)重要毒性作用是生長抑制效應(yīng)。動(dòng)物在長期低劑量攝入T-2毒素污染的飼料后會(huì)引起慢性毒性作用,包括食欲不振、生長發(fā)育遲緩、體重降低等,并導(dǎo)致動(dòng)物飼料利用率明顯降低,給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然目前對(duì)T-2毒素引起的動(dòng)物生長抑制有一定的研究,但總的來說,T-2毒素對(duì)動(dòng)物生長抑制的作用機(jī)制還不清楚。研究表明T-2毒素可能通過改變大腦中五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平,降低動(dòng)物的食欲;或者通過抑制動(dòng)物腸上皮細(xì)胞的增殖,損害腸道微絨毛,導(dǎo)致腸道營養(yǎng)吸收受阻。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)T-2毒素的...

【文章頁數(shù)】：257 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 立題依據(jù)
    1.2 研究進(jìn)展
        1.2.1 單端孢霉烯族毒素概述
        1.2.2 T-2毒素概述
        1.2.3 T-2毒素分子作用靶點(diǎn)研究進(jìn)展
        1.2.4 T-2毒素誘導(dǎo)線粒體損傷和氧化應(yīng)激研究進(jìn)展
        1.2.5 轉(zhuǎn)錄因子NRF-2的研究進(jìn)展
    1.3 研究內(nèi)容和目標(biāo)
        1.3.1 研究內(nèi)容
        1.3.2 研究目標(biāo)
2 T-2毒素誘導(dǎo)GH3細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激和功能變化研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.1.6 CCK-8法檢測T-2毒素對(duì)GH3細(xì)胞活力影響
        2.1.7 細(xì)胞內(nèi)氧自由基檢測
        2.1.8 ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量
        2.1.9 細(xì)胞GSH含量檢測
        2.1.10 抗氧化酶SOD活性檢測
        2.1.11 細(xì)胞線粒體膜電位ΔΨm檢測
        2.1.12 細(xì)胞mt-DNA拷貝數(shù)檢測
        2.1.13 細(xì)胞線粒體ATP水平檢測
        2.1.14 細(xì)胞呼吸鏈復(fù)合物I酶活性檢測
        2.1.15 透射電鏡觀察GH3細(xì)胞形態(tài)
        2.1.16 細(xì)胞凋亡檢測
        2.1.17 qRT-PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)
        2.1.18 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 GH3細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2.2 細(xì)胞總RNA質(zhì)量鑒定
        2.2.3 T-2毒素對(duì)GH3細(xì)胞毒性
        2.2.4 T-2毒素誘導(dǎo)GH3細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激
        2.2.5 T-2毒素誘導(dǎo)GH3細(xì)胞線粒體功能變化
        2.2.6 T-2毒素激活線粒體依賴的細(xì)胞凋亡
    2.3 討論
        2.3.1 T-2毒素誘導(dǎo)GH3細(xì)胞氧化應(yīng)激并激活抗氧化系統(tǒng)
        2.3.2 線粒體是T-2毒素另一個(gè)重要的分子作用靶點(diǎn)
        2.3.3 T-2毒素激活GH3細(xì)胞線粒體生物合成
    2.4 小結(jié)
3 線粒體呼吸鏈核心鐵硫蛋白亞基Ndufs3的功能研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 細(xì)胞株
        3.1.2 質(zhì)粒
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 溶液配制
        3.1.5 主要儀器
        3.1.6 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代和凍存
        3.1.7 利用siRNA干擾Ndufs3基因表達(dá)
        3.1.8 Ndufs3過表達(dá)實(shí)驗(yàn)
        3.1.9 Western blot方法測定蛋白表達(dá)水平
        3.1.10 qRT-PCR檢測RNA干擾水平
        3.1.11 檢測線粒體超氧自由基、ΔΨm和ATP水平
        3.1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 siRNA轉(zhuǎn)染效果和RNA干擾Ndufs3效果評(píng)價(jià)
        3.2.2 敲低Ndufs3增加線粒體超氧自由基產(chǎn)生
        3.2.3 敲低Ndufs3抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性
        3.2.4 敲低Ndufs3降低細(xì)胞線粒體ΔΨm
        3.2.5 敲低Ndufs3不改變線粒體ATP水平
        3.2.6 通過pcDNA-3.1⁺載體在GH3細(xì)胞中過表達(dá)Ndufs
        3.2.7 pcDNA3.1⁺-Ndufs3重組載體構(gòu)建
        3.2.8 Ndufs3過表達(dá)驗(yàn)證
        3.2.9 過表達(dá)Ndufs3不改變線粒體超氧自由基
        3.2.10 過表達(dá)Ndufs3不影響線粒體ΔΨm
        3.2.11 過表達(dá)Ndufs3不改變線粒體ATP產(chǎn)生
    3.3 討論
        3.3.1 Ndufs3能夠維持GH3細(xì)胞線粒體功能穩(wěn)定
        3.3.2 Ndufs3過表達(dá)不能保護(hù)線粒體功能
    3.4 小結(jié)
4 核呼吸因子2在T-2毒素誘導(dǎo)線粒體功能變化中的作用研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 細(xì)胞株
        4.1.2 質(zhì)粒
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 溶液配制
        4.1.5 主要儀器
        4.1.6 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代和凍存
        4.1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)
        4.1.8 抑制劑篩選調(diào)控NRF-2的信號(hào)通路
        4.1.9 慢病毒構(gòu)建NRF-2沉默細(xì)胞株
        4.1.10 染色質(zhì)免疫共沉淀
        4.1.11 Western blot和qRT-PCR確定NRF-2干擾效率
        4.1.12 ROS、ATP、復(fù)合物I活性和mt-DNA拷貝數(shù)檢測
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 NRF-2在GH3細(xì)胞中定位在細(xì)胞核
        4.2.2 T-2處理GH3細(xì)胞后增加NRF-2表達(dá)
        4.2.3 調(diào)控NRF-2表達(dá)的上游信號(hào)通路
        4.2.4 敲低NRF-2改變GH3細(xì)胞線粒體功能
        4.2.5 ChIP結(jié)合PCR和高通量測序確定NRF-2靶基因
        4.2.6 敲低NRF-2抑制靶基因的表達(dá)
    4.3 討論
        4.3.1 T-2毒素誘導(dǎo)NRF-2核內(nèi)表達(dá)
        4.3.2 NRF-2參與了T-2毒素誘導(dǎo)的線粒體功能變化
        4.3.3 NRF-2控制線粒體靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響線粒體功能
        4.3.4 NRF-2通過其他形式來影響線粒體
        4.3.5 NRF-2可能參與的其他功能
    4.4 小結(jié)
5 T-2毒素誘導(dǎo)GH3細(xì)胞自噬和線粒體自噬
    5.1 材料與方法
        5.1.1 細(xì)胞株
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 溶液配制
        5.1.4 主要儀器
        5.1.5 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代和凍存
        5.1.6 通過腺相關(guān)病毒在GH3中穩(wěn)定表達(dá)mRFP-GFP-LC
        5.1.7 GH3細(xì)胞中細(xì)胞自噬的觀察
        5.1.8 RNA干擾線粒體自噬基因Atg5、Pink1和NIX
        5.1.9 GH3細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)Mito7-mKeima蛋白
        5.1.10 通過Mito7-mKeima確定線粒體自噬
        5.1.11 透射電鏡觀察線粒體自噬
        5.1.12 qRT-PCR檢測線粒體融合與分裂基因表達(dá)
        5.1.13 線粒體ATP和細(xì)胞凋亡分析
        5.1.14 siRNA轉(zhuǎn)染GH3細(xì)胞沉默Nrf2基因
        5.1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 AAV病毒包裝和感染GH3細(xì)胞
        5.2.2 T-2毒素能夠誘導(dǎo)GH3細(xì)胞自噬
        5.2.3 Atg5介導(dǎo)T-2毒素誘導(dǎo)的GH3細(xì)胞自噬
        5.2.4 表達(dá)Mito7-mKeima的慢病毒包裝和感染GH3細(xì)胞
        5.2.5 T-2毒素能夠誘導(dǎo)GH3細(xì)胞線粒體自噬
        5.2.6 Atg5介導(dǎo)T-2毒素誘導(dǎo)GH3細(xì)胞線粒體自噬
        5.2.7 透射電鏡觀察T-2毒素誘導(dǎo)GH3細(xì)胞線粒體自噬
        5.2.8 T-2毒素誘導(dǎo)線粒體自噬關(guān)鍵基因表達(dá)
        5.2.9 cAMP-PKA-CREB-Nrf2-Pink1調(diào)控GH3細(xì)胞線粒體自噬
        5.2.10 抑制線粒體自噬降低GH3細(xì)胞線粒體功能
        5.2.11 抑制線粒體自噬促進(jìn)T-2毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
    5.3 討論
        5.3.1 T-2毒素誘導(dǎo)GH3細(xì)胞自噬和線粒體自噬
        5.3.2 cAMP-PKA-CREB-Nrf2-Pink1是調(diào)控線粒體自噬的通路
        5.3.3 線粒體自噬保護(hù)GH3細(xì)胞線粒體功能并降低細(xì)胞死亡
    5.4 小結(jié)
6 全文創(chuàng)新性總結(jié)
7 單端孢霉烯族毒素引起的線粒體毒性研究進(jìn)展(綜述)
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄



本文編號(hào)：3802257