本文關(guān)鍵詞：豬抗藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病相關(guān)基因的鑒定與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬病已成為當(dāng)前制約養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素之一,其中豬藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒病為危害世界養(yǎng)豬生產(chǎn)的兩大重要的疫病。PRRSV和PCV2都是能導(dǎo)致豬繁殖障礙的主要病原,此外,造成豬的免疫抑制,引起其他病原微生物的繼發(fā)或并發(fā)感染,給世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬的遺傳學(xué)組成能夠影響宿主對(duì)病毒的易感。研究表明,不同的豬種間對(duì)PRRSV和PCV2相關(guān)疾病的易感性存在差異是由于宿主遺傳差異導(dǎo)致的。本研究首先對(duì)與PRRSV抗性相關(guān)的兩個(gè)候選基因USP18和Mx1進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)功能分析,然后在實(shí)驗(yàn)條件下,研究遺傳背景不同的萊蕪豬和大長雜交商品豬對(duì)PCV2易感是否存在差異以及探討抗性或易感差異的分子機(jī)制,尋找與豬抗PPRSV和PCV2有關(guān)的分子標(biāo)記。主要的研究結(jié)果如下:1.本研究對(duì)比了中國地方豬種大蒲蓮豬和杜-大-長雜交商品豬USP18基因啟動(dòng)子區(qū)活性,以及篩選了單核苷酸多態(tài)性對(duì)USP18轉(zhuǎn)錄的影響。我們發(fā)現(xiàn)大蒲蓮豬的啟動(dòng)子活性明顯高于杜-大-長雜交商品豬(P0.05);啟動(dòng)子刪除試驗(yàn)中,當(dāng)啟動(dòng)子從-1790刪除到-1314時(shí),其轉(zhuǎn)錄活性下降約60%(P0.05);同時(shí)MARC-145細(xì)胞感染PRRSV前后,在此區(qū)段的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G 1533A均能提高USP18基因mRNA的表達(dá)。群體遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示等位基因A只存在于對(duì)PRRSV抗性更強(qiáng)的中國豬種中。這些結(jié)果表明豬USP18基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G 1533A多態(tài)性是抗PRRSV的一個(gè)潛在的DNA分子標(biāo)記。2.豬Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)的-2713到-2565和-688到-431兩個(gè)區(qū)域存在順式作用元件。通過對(duì)擴(kuò)增的豬Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行測(cè)序和比對(duì),發(fā)現(xiàn)在-547位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)275bp的短散布重復(fù)元件(SINE)。等位基因B(有275bp的插入)主要存在于中國地方豬種中,而在西方瘦肉品種中頻率很低。分別將含有和不含275bp片段插入的啟動(dòng)子通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞,比較其熒光素酶活性。結(jié)果顯示不論是在感染豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)前還是感染后,275bp片段的插入均顯著提高了熒光素酶的活性(P0.05)。這些結(jié)果表明Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)-547位點(diǎn)的SINE插入多態(tài)性是一個(gè)潛在的抗PRRSV的DNA分子標(biāo)記。3.隨機(jī)采樣6周齡的15頭萊蕪豬和15頭大長雜交商品豬。所有的豬只PCV1,PCV2,PRRSV和PPV抗原抗體檢測(cè)為陰性。隨機(jī)分成四組,萊蕪豬和大長雜交商品豬攻毒組各10頭,對(duì)照組各5頭。攻毒組肌肉注射3ml(103.8tcid50/ml)的pcv2-sd毒株,對(duì)照組接種等量的磷酸鹽緩沖液。攻毒當(dāng)天被記為0d。攻毒后每天測(cè)量體溫,觀察臨床癥狀,分別在0d、4d、7d、10d、14d、21d、28d、35d稱重、采集血液,利用pcr及絕對(duì)定量pcr對(duì)血清中的pcv2dna病毒拷貝數(shù)及細(xì)胞因子的變化(il-1β、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12、gm-csf、ifn-γ、tgf-β1和tnfα)進(jìn)行分析,elisa試劑盒檢測(cè)igg的變化。35d剖殺時(shí)采集肺臟、扁桃體、胸腺、回腸、脾臟、肝臟和淋巴結(jié)等組織,10%福爾馬林溶液固定,制作組織切片,he染色觀察病理變化。結(jié)果表明:從攻毒的0d到35d,攻毒組萊蕪豬與攻毒組商品豬相比,60%(6/10)的商品豬出現(xiàn)了豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的典型臨床癥狀,例如食欲下降,咳嗽,拉稀和漸進(jìn)性消瘦,偶爾打噴嚏;攻毒14d后,商品豬最顯著的癥狀是皮膚上出現(xiàn)圓形或形狀不規(guī)則的紅紫斑和丘疹,主要是在背部和后退部位。大約一半的商品豬攻毒后14d到28d間出現(xiàn)了呼吸急促。萊蕪豬未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,只出現(xiàn)輕微的厭食,咳嗽和發(fā)熱等癥狀。與對(duì)照組相比,商品豬從攻毒后的第10d開始直腸溫度高于40℃一直持續(xù)到14d。萊蕪豬體溫變化不顯著。與對(duì)照組比,在整個(gè)攻毒期間萊蕪豬的體重?zé)o顯著變化,而商品豬在攻毒后21d到35d之間平均體重明顯低于對(duì)照組。大長雜交商品豬的肺臟出現(xiàn)不同程度的肺充血,嚴(yán)重病例肺泡出血,肺小葉間質(zhì)明顯增寬,出血嚴(yán)重,支氣管處出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤。肝臟為輕度到中度的肝萎縮,花斑肝,被膜下淋巴細(xì)胞大量減少,而萊蕪豬攻毒后未出現(xiàn)此類臨床癥狀。萊蕪豬與大長豬的igg總含量在感染pcv2期間沒有出現(xiàn)顯著差異,但是萊蕪豬igg的總含量高于大長豬的總含量。在感染pcv2的早期,萊蕪豬血清中il-6(p0.01)、il-4、il-8和tgf-β1水平均顯著上升(p0.05),大長雜交豬血清中的炎性細(xì)胞因子tnf-α的蛋白水平顯著上升(p0.05),趨化因子il-8的表達(dá)量持續(xù)下降,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子il-10表達(dá)水平后期突然顯著升高(p0.05),綜合分析上述細(xì)胞因子的表達(dá)動(dòng)態(tài)表明,pcv2感染后大長雜交豬出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致豬早期抗病毒能力和趨化功能降低,使大長雜交豬的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能出現(xiàn)抑制和紊亂。大長雜交商品豬血清中的pcv2dna病毒的拷貝數(shù)均高于萊蕪豬,且在攻毒后第35d達(dá)到了顯著性差異(p0.05)。4.利用rna-seq技術(shù)分析了萊蕪豬和大長雜交商品豬感染pcv2后肺臟組織的差異基因表達(dá)的情況,兩個(gè)品種共找出了374個(gè)差異表達(dá)基因,萊蕪豬攻毒組與對(duì)照組相比,有83個(gè)上調(diào)基因和86個(gè)下調(diào)基因;商品豬中187個(gè)上調(diào)基因,18個(gè)下調(diào)基因。在這些差異表達(dá)基因中,兩個(gè)豬種中5個(gè)共同上調(diào)基因和4個(gè)下調(diào)基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋發(fā)現(xiàn)大長雜交商品豬中有150、160和156個(gè)基因被注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能的條目中;萊蕪豬有149、134和134個(gè)基因被分別注釋相應(yīng)的三個(gè)條目中。374個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到了KEGG數(shù)據(jù)庫中的299條通路中,每條通路中的差異表達(dá)基因從1到25個(gè)不等。其中具有代表性的通路是補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、RIG-I-like受體信號(hào)通路和B細(xì)胞受體通路。定量PCR結(jié)果顯示,補(bǔ)體凝血級(jí)聯(lián)通路中的肺組織的損傷有關(guān)的4個(gè)基因(TFPI、SERPINC1、SERPINA1和SERPINA5)均在攻毒的萊蕪豬中顯著表達(dá)上調(diào),而在大長雜交商品豬中的無明顯表達(dá)變化。通過對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析,初步篩選出導(dǎo)致PCV2感染產(chǎn)生不同的肺部病變的差異表達(dá)基因。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)與PRRSV抗性相關(guān)的兩個(gè)基因USP18和Mx1進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)分析,結(jié)果表明豬USP18基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G 1533A多態(tài)性和Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)-547位點(diǎn)的SINE插入多態(tài)性均可以作為潛在的抗PRRSV的DNA分子標(biāo)記。然后對(duì)地方豬種和雜交商品豬感染PCV2抗性或易感性是否存在差異以及存在此差異的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示,萊蕪豬和大長雜交商品豬對(duì)PCV2感染的生物學(xué)反應(yīng)有所不同,二者在感染PCV2后肺組織中基因的表達(dá)也具有較大差異。定量PCR驗(yàn)證分析了凝血通路中的與肺損傷相關(guān)的4個(gè)基因(TFPI、SERPINC1、SERPINA1和SERPINA5),證明PCV2感染后這4個(gè)基因在攻毒后的萊蕪豬和大長雜交商品豬的肺組織中的mRNA表達(dá)水平存在差異。本研究尋找到了與大長雜交商品豬感染PCV2后出現(xiàn)嚴(yán)重肺組織病變的相關(guān)易感基因,為進(jìn)一步探討豬PCV2的發(fā)病機(jī)制和得到與抗PCV2有關(guān)的DNA分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 豬圓環(huán)病毒 數(shù)字基因表達(dá)譜 細(xì)胞因子 差異表達(dá)基因 絲氨酸蛋白酶抑制子A1
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 符號(hào)說明5-10
• 中文摘要10-13
• Abstract13-18
• 1 前言18-38
• 1.1 豬藍(lán)耳病的相關(guān)研究進(jìn)展18-21
• 1.1.1 豬對(duì)PRRSV感染存在抗性差異18-19
• 1.1.2 USP18基因的研究現(xiàn)狀19-20
• 1.1.3 Mx1基因的研究現(xiàn)狀20-21
• 1.2 豬圓環(huán)病毒的研究進(jìn)展21-33
• 1.2.1 豬圓環(huán)病毒基因組和分類22-23
• 1.2.2 豬圓環(huán)病毒的起源和演化23-24
• 1.2.3 豬圓環(huán)病毒的流行現(xiàn)狀24-27
• 1.2.4 臨床疾病27-29
• 1.2.5 PCV2發(fā)病機(jī)制29-32
• 1.2.6 在PCV2發(fā)病機(jī)制中細(xì)胞因子的作用32-33
• 1.3 RNA-seq技術(shù)33-35
• 1.4 SERPINA1基因的研究現(xiàn)狀35-36
• 1.5 本研究的目的及意義36-38
• 2 材料與方法38-69
• 2.1 試驗(yàn)材料38-42
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及攻毒38
• 2.1.2 樣品采集38
• 2.1.3 毒株38
• 2.1.4 菌株及載體38
• 2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備38-39
• 2.1.6 主要試劑和試劑盒及來源39-40
• 2.1.7 常用試劑的配制40-41
• 2.1.8 主要數(shù)據(jù)庫和生物學(xué)軟件41-42
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法42-69
• 2.2.1 豬基因組DNA的提取42
• 2.2.2 總RNA的提取及檢測(cè)42-44
• 2.2.3 質(zhì)粒DNA的提�。═iangen試劑盒）44
• 2.2.4 凝膠回收PCR產(chǎn)物44-45
• 2.2.5 USP18和Mx1基因 5'調(diào)控區(qū)分析45-52
• 2.2.6 豬對(duì)PCV2感染的生物學(xué)反應(yīng)52-61
• 2.2.7 RNA-seq分析肺組織差異表達(dá)基因61-69
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)分析69
• 3 結(jié)果與分析69-104
• 3.1 USP18基因 5'調(diào)控區(qū)多態(tài)性分析69-73
• 3.1.1 大蒲蓮豬和大長雜交商品豬啟動(dòng)子活性比較69-70
• 3.1.2 USP18基因啟動(dòng)子刪除載體雙熒光素酶活性分析70-71
• 3.1.3 USP18基因啟動(dòng)子區(qū)突變對(duì)PRRSV感染的影響71-72
• 3.1.4 不同品種中G 1533A位點(diǎn)的多態(tài)性分析72-73
• 3.2 Mx1基因 5'調(diào)控區(qū)多態(tài)分析73-76
• 3.2.1 Mx1基因 5'調(diào)控區(qū)擴(kuò)增及載體構(gòu)建73-74
• 3.2.2 Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)刪除載體熒光素酶活性比較74-75
• 3.2.3 PRRSV感染對(duì)Mx1基因不同載體啟動(dòng)子活性影響75
• 3.2.4 不同豬種中?547位點(diǎn)多態(tài)性的群體檢測(cè)75-76
• 3.3 不同品種豬對(duì)PCV2感染的生物學(xué)反應(yīng)76-87
• 3.3.1 萊蕪豬和大長雜交商品豬對(duì)感染PCV2后的臨床癥狀比較76-77
• 3.3.2 萊蕪豬和大長雜交商品豬體溫體重變化77-78
• 3.3.3 剖檢病變78-79
• 3.3.4 PCV2感染 35d時(shí)萊蕪豬和大長雜交商品豬肺臟和脾臟的病理變化79-80
• 3.3.5 PCV2感染對(duì)免疫球蛋白IgG的影響80-82
• 3.3.6 PCR測(cè)定萊蕪豬和大長雜交商品豬血清中PCV2病毒的含量82-83
• 3.3.7 萊蕪豬和大長雜交商品豬感染PCV2后血清中病毒拷貝數(shù)變化83-85
• 3.3.8 PCV2感染不同時(shí)期豬細(xì)胞因子蛋白水平表達(dá)的變化85-87
• 3.4 萊蕪豬和大長雜交商品豬肺組織差異表達(dá)基因的篩選87-104
• 3.4.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)87-88
• 3.4.2 表達(dá)譜測(cè)序及生物信息學(xué)分析88-94
• 3.4.3 差異表達(dá)基因的篩選94-96
• 3.4.4 差異表達(dá)基因的GO功能注釋結(jié)果96-99
• 3.4.5 差異基因KEGG分析99-101
• 3.4.6 差異表達(dá)基因的定量PCR檢測(cè)101-104
• 4 討論104-111
• 4.1 與PRRSV抗性相關(guān)的兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性分析104-106
• 4.1.1 USP18基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性分析104-105
• 4.1.2 Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性分析105-106
• 4.2 萊蕪豬和大長雜交商品豬對(duì)PCV2感染的臨床癥狀106-107
• 4.3 PCV2感染后血清中細(xì)胞因子蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化107-109
• 4.4 差異表達(dá)基因的篩選與鑒定109-111
• 5 結(jié)論111-112
• 參考 文獻(xiàn)112-126
• 致謝126-127
• 附錄127-129
• 博士期間發(fā)表論文和專利情況129-130

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3 冬方;鯽魚耐鹽堿基因的篩選及驗(yàn)證[D];上海海洋大學(xué);2015年

4 陳明明;基于基因本體術(shù)語相似性的通路功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

5 王洋;多氯聯(lián)苯代謝過程中紅球菌應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的研究[D];山西大學(xué);2015年

6 唐奇;CRYAB基因在HCC中的表達(dá)、臨床預(yù)后分析及抗凋亡功能研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

7 楊波波;不同腫瘤基因表達(dá)分析中內(nèi)參基因的選擇和研究[D];西北大學(xué);2014年

8 陳海英;HP450基因的克隆及其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-HP450的構(gòu)建和鑒定[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2006年

9 郭建軍;轉(zhuǎn)反義TrxS基因小麥種子發(fā)育過程中基因表達(dá)差異分析[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

10 梁正翠;鴨的色素相關(guān)基因ASIP和AGRP的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：豬抗藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病相關(guān)基因的鑒定與功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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