發(fā)布時間：2017-05-18 21:03

  本文關鍵詞：豬抗藍耳病、圓環(huán)病毒病相關基因的鑒定與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬病已成為當前制約養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的關鍵因素之一,其中豬藍耳病和圓環(huán)病毒病為危害世界養(yǎng)豬生產(chǎn)的兩大重要的疫病。PRRSV和PCV2都是能導致豬繁殖障礙的主要病原,此外,造成豬的免疫抑制,引起其他病原微生物的繼發(fā)或并發(fā)感染,給世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。豬的遺傳學組成能夠影響宿主對病毒的易感。研究表明,不同的豬種間對PRRSV和PCV2相關疾病的易感性存在差異是由于宿主遺傳差異導致的。本研究首先對與PRRSV抗性相關的兩個候選基因USP18和Mx1進行了啟動子區(qū)功能分析,然后在實驗條件下,研究遺傳背景不同的萊蕪豬和大長雜交商品豬對PCV2易感是否存在差異以及探討抗性或易感差異的分子機制,尋找與豬抗PPRSV和PCV2有關的分子標記。主要的研究結果如下:1.本研究對比了中國地方豬種大蒲蓮豬和杜-大-長雜交商品豬USP18基因啟動子區(qū)活性,以及篩選了單核苷酸多態(tài)性對USP18轉(zhuǎn)錄的影響。我們發(fā)現(xiàn)大蒲蓮豬的啟動子活性明顯高于杜-大-長雜交商品豬(P0.05);啟動子刪除試驗中,當啟動子從-1790刪除到-1314時,其轉(zhuǎn)錄活性下降約60%(P0.05);同時MARC-145細胞感染PRRSV前后,在此區(qū)段的單核苷酸多態(tài)位點G 1533A均能提高USP18基因mRNA的表達。群體遺傳學分析結果顯示等位基因A只存在于對PRRSV抗性更強的中國豬種中。這些結果表明豬USP18基因啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點G 1533A多態(tài)性是抗PRRSV的一個潛在的DNA分子標記。2.豬Mx1基因啟動子區(qū)的-2713到-2565和-688到-431兩個區(qū)域存在順式作用元件。通過對擴增的豬Mx1基因啟動子區(qū)進行測序和比對,發(fā)現(xiàn)在-547位點發(fā)現(xiàn)了一個275bp的短散布重復元件(SINE)。等位基因B(有275bp的插入)主要存在于中國地方豬種中,而在西方瘦肉品種中頻率很低。分別將含有和不含275bp片段插入的啟動子通過瞬時轉(zhuǎn)染MARC-145細胞,比較其熒光素酶活性。結果顯示不論是在感染豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)前還是感染后,275bp片段的插入均顯著提高了熒光素酶的活性(P0.05)。這些結果表明Mx1基因啟動子區(qū)-547位點的SINE插入多態(tài)性是一個潛在的抗PRRSV的DNA分子標記。3.隨機采樣6周齡的15頭萊蕪豬和15頭大長雜交商品豬。所有的豬只PCV1,PCV2,PRRSV和PPV抗原抗體檢測為陰性。隨機分成四組,萊蕪豬和大長雜交商品豬攻毒組各10頭,對照組各5頭。攻毒組肌肉注射3ml(103.8tcid50/ml)的pcv2-sd毒株,對照組接種等量的磷酸鹽緩沖液。攻毒當天被記為0d。攻毒后每天測量體溫,觀察臨床癥狀,分別在0d、4d、7d、10d、14d、21d、28d、35d稱重、采集血液,利用pcr及絕對定量pcr對血清中的pcv2dna病毒拷貝數(shù)及細胞因子的變化(il-1β、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12、gm-csf、ifn-γ、tgf-β1和tnfα)進行分析,elisa試劑盒檢測igg的變化。35d剖殺時采集肺臟、扁桃體、胸腺、回腸、脾臟、肝臟和淋巴結等組織,10%福爾馬林溶液固定,制作組織切片,he染色觀察病理變化。結果表明:從攻毒的0d到35d,攻毒組萊蕪豬與攻毒組商品豬相比,60%(6/10)的商品豬出現(xiàn)了豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的典型臨床癥狀,例如食欲下降,咳嗽,拉稀和漸進性消瘦,偶爾打噴嚏;攻毒14d后,商品豬最顯著的癥狀是皮膚上出現(xiàn)圓形或形狀不規(guī)則的紅紫斑和丘疹,主要是在背部和后退部位。大約一半的商品豬攻毒后14d到28d間出現(xiàn)了呼吸急促。萊蕪豬未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,只出現(xiàn)輕微的厭食,咳嗽和發(fā)熱等癥狀。與對照組相比,商品豬從攻毒后的第10d開始直腸溫度高于40℃一直持續(xù)到14d。萊蕪豬體溫變化不顯著。與對照組比,在整個攻毒期間萊蕪豬的體重無顯著變化,而商品豬在攻毒后21d到35d之間平均體重明顯低于對照組。大長雜交商品豬的肺臟出現(xiàn)不同程度的肺充血,嚴重病例肺泡出血,肺小葉間質(zhì)明顯增寬,出血嚴重,支氣管處出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤。肝臟為輕度到中度的肝萎縮,花斑肝,被膜下淋巴細胞大量減少,而萊蕪豬攻毒后未出現(xiàn)此類臨床癥狀。萊蕪豬與大長豬的igg總含量在感染pcv2期間沒有出現(xiàn)顯著差異,但是萊蕪豬igg的總含量高于大長豬的總含量。在感染pcv2的早期,萊蕪豬血清中il-6(p0.01)、il-4、il-8和tgf-β1水平均顯著上升(p0.05),大長雜交豬血清中的炎性細胞因子tnf-α的蛋白水平顯著上升(p0.05),趨化因子il-8的表達量持續(xù)下降,調(diào)節(jié)細胞因子il-10表達水平后期突然顯著升高(p0.05),綜合分析上述細胞因子的表達動態(tài)表明,pcv2感染后大長雜交豬出現(xiàn)急性炎癥反應,導致豬早期抗病毒能力和趨化功能降低,使大長雜交豬的免疫調(diào)節(jié)機能出現(xiàn)抑制和紊亂。大長雜交商品豬血清中的pcv2dna病毒的拷貝數(shù)均高于萊蕪豬,且在攻毒后第35d達到了顯著性差異(p0.05)。4.利用rna-seq技術分析了萊蕪豬和大長雜交商品豬感染pcv2后肺臟組織的差異基因表達的情況,兩個品種共找出了374個差異表達基因,萊蕪豬攻毒組與對照組相比,有83個上調(diào)基因和86個下調(diào)基因;商品豬中187個上調(diào)基因,18個下調(diào)基因。在這些差異表達基因中,兩個豬種中5個共同上調(diào)基因和4個下調(diào)基因。對差異表達基因進行GO功能注釋發(fā)現(xiàn)大長雜交商品豬中有150、160和156個基因被注釋到生物學過程、細胞組分和分子功能的條目中;萊蕪豬有149、134和134個基因被分別注釋相應的三個條目中。374個差異表達基因被注釋到了KEGG數(shù)據(jù)庫中的299條通路中,每條通路中的差異表達基因從1到25個不等。其中具有代表性的通路是補體和凝血級聯(lián)通路、RIG-I-like受體信號通路和B細胞受體通路。定量PCR結果顯示,補體凝血級聯(lián)通路中的肺組織的損傷有關的4個基因(TFPI、SERPINC1、SERPINA1和SERPINA5)均在攻毒的萊蕪豬中顯著表達上調(diào),而在大長雜交商品豬中的無明顯表達變化。通過對表達譜數(shù)據(jù)的分析,初步篩選出導致PCV2感染產(chǎn)生不同的肺部病變的差異表達基因。綜上所述,本實驗首先對與PRRSV抗性相關的兩個基因USP18和Mx1進行了啟動子區(qū)多態(tài)分析,結果表明豬USP18基因啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點G 1533A多態(tài)性和Mx1基因啟動子區(qū)-547位點的SINE插入多態(tài)性均可以作為潛在的抗PRRSV的DNA分子標記。然后對地方豬種和雜交商品豬感染PCV2抗性或易感性是否存在差異以及存在此差異的分子機制進行了探討。結果顯示,萊蕪豬和大長雜交商品豬對PCV2感染的生物學反應有所不同,二者在感染PCV2后肺組織中基因的表達也具有較大差異。定量PCR驗證分析了凝血通路中的與肺損傷相關的4個基因(TFPI、SERPINC1、SERPINA1和SERPINA5),證明PCV2感染后這4個基因在攻毒后的萊蕪豬和大長雜交商品豬的肺組織中的mRNA表達水平存在差異。本研究尋找到了與大長雜交商品豬感染PCV2后出現(xiàn)嚴重肺組織病變的相關易感基因,為進一步探討豬PCV2的發(fā)病機制和得到與抗PCV2有關的DNA分子標記奠定基礎。
【關鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 豬圓環(huán)病毒 數(shù)字基因表達譜 細胞因子 差異表達基因 絲氨酸蛋白酶抑制子A1
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 符號說明5-10
• 中文摘要10-13
• Abstract13-18
• 1 前言18-38
• 1.1 豬藍耳病的相關研究進展18-21
• 1.1.1 豬對PRRSV感染存在抗性差異18-19
• 1.1.2 USP18基因的研究現(xiàn)狀19-20
• 1.1.3 Mx1基因的研究現(xiàn)狀20-21
• 1.2 豬圓環(huán)病毒的研究進展21-33
• 1.2.1 豬圓環(huán)病毒基因組和分類22-23
• 1.2.2 豬圓環(huán)病毒的起源和演化23-24
• 1.2.3 豬圓環(huán)病毒的流行現(xiàn)狀24-27
• 1.2.4 臨床疾病27-29
• 1.2.5 PCV2發(fā)病機制29-32
• 1.2.6 在PCV2發(fā)病機制中細胞因子的作用32-33
• 1.3 RNA-seq技術33-35
• 1.4 SERPINA1基因的研究現(xiàn)狀35-36
• 1.5 本研究的目的及意義36-38
• 2 材料與方法38-69
• 2.1 試驗材料38-42
• 2.1.1 試驗動物及攻毒38
• 2.1.2 樣品采集38
• 2.1.3 毒株38
• 2.1.4 菌株及載體38
• 2.1.5 主要實驗儀器和設備38-39
• 2.1.6 主要試劑和試劑盒及來源39-40
• 2.1.7 常用試劑的配制40-41
• 2.1.8 主要數(shù)據(jù)庫和生物學軟件41-42
• 2.2 實驗方法42-69
• 2.2.1 豬基因組DNA的提取42
• 2.2.2 總RNA的提取及檢測42-44
• 2.2.3 質(zhì)粒DNA的提�。═iangen試劑盒）44
• 2.2.4 凝膠回收PCR產(chǎn)物44-45
• 2.2.5 USP18和Mx1基因 5'調(diào)控區(qū)分析45-52
• 2.2.6 豬對PCV2感染的生物學反應52-61
• 2.2.7 RNA-seq分析肺組織差異表達基因61-69
• 2.2.8 統(tǒng)計分析69
• 3 結果與分析69-104
• 3.1 USP18基因 5'調(diào)控區(qū)多態(tài)性分析69-73
• 3.1.1 大蒲蓮豬和大長雜交商品豬啟動子活性比較69-70
• 3.1.2 USP18基因啟動子刪除載體雙熒光素酶活性分析70-71
• 3.1.3 USP18基因啟動子區(qū)突變對PRRSV感染的影響71-72
• 3.1.4 不同品種中G 1533A位點的多態(tài)性分析72-73
• 3.2 Mx1基因 5'調(diào)控區(qū)多態(tài)分析73-76
• 3.2.1 Mx1基因 5'調(diào)控區(qū)擴增及載體構建73-74
• 3.2.2 Mx1基因啟動子區(qū)刪除載體熒光素酶活性比較74-75
• 3.2.3 PRRSV感染對Mx1基因不同載體啟動子活性影響75
• 3.2.4 不同豬種中?547位點多態(tài)性的群體檢測75-76
• 3.3 不同品種豬對PCV2感染的生物學反應76-87
• 3.3.1 萊蕪豬和大長雜交商品豬對感染PCV2后的臨床癥狀比較76-77
• 3.3.2 萊蕪豬和大長雜交商品豬體溫體重變化77-78
• 3.3.3 剖檢病變78-79
• 3.3.4 PCV2感染 35d時萊蕪豬和大長雜交商品豬肺臟和脾臟的病理變化79-80
• 3.3.5 PCV2感染對免疫球蛋白IgG的影響80-82
• 3.3.6 PCR測定萊蕪豬和大長雜交商品豬血清中PCV2病毒的含量82-83
• 3.3.7 萊蕪豬和大長雜交商品豬感染PCV2后血清中病毒拷貝數(shù)變化83-85
• 3.3.8 PCV2感染不同時期豬細胞因子蛋白水平表達的變化85-87
• 3.4 萊蕪豬和大長雜交商品豬肺組織差異表達基因的篩選87-104
• 3.4.1 總RNA質(zhì)量檢測87-88
• 3.4.2 表達譜測序及生物信息學分析88-94
• 3.4.3 差異表達基因的篩選94-96
• 3.4.4 差異表達基因的GO功能注釋結果96-99
• 3.4.5 差異基因KEGG分析99-101
• 3.4.6 差異表達基因的定量PCR檢測101-104
• 4 討論104-111
• 4.1 與PRRSV抗性相關的兩個基因啟動子區(qū)多態(tài)性分析104-106
• 4.1.1 USP18基因啟動子區(qū)多態(tài)性分析104-105
• 4.1.2 Mx1基因啟動子區(qū)多態(tài)性分析105-106
• 4.2 萊蕪豬和大長雜交商品豬對PCV2感染的臨床癥狀106-107
• 4.3 PCV2感染后血清中細胞因子蛋白水平的動態(tài)變化107-109
• 4.4 差異表達基因的篩選與鑒定109-111
• 5 結論111-112
• 參考 文獻112-126
• 致謝126-127
• 附錄127-129
• 博士期間發(fā)表論文和專利情況129-130

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