轉(zhuǎn)基因水稻的研發(fā)技術(shù)日益成熟,越來越多的轉(zhuǎn)化體獲得不同國家的安全許可或進(jìn)入田間試驗(yàn),但作為重要主糧,其產(chǎn)業(yè)化及安全性問題引起社會廣泛關(guān)注,近年來,有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻的突發(fā)事件時有發(fā)生,引起了不必要的貿(mào)易摩擦和民眾恐慌,國內(nèi)外都高度重視轉(zhuǎn)基因水稻的安全評價與監(jiān)管檢測工作。因此,加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究,提升監(jiān)管能力水平十分必要。本研究首先針對基于硅基質(zhì)膜柱的基因組DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化,開發(fā)了新型植物種子基因組DNA提取試劑盒,同時對水稻種子研磨粒度與基因組DNA提取質(zhì)量之間關(guān)系進(jìn)行分析,提高基因組DNA質(zhì)量和得率,為下一步PCR檢測提供基礎(chǔ);其次對已發(fā)現(xiàn)的和本研究開發(fā)的水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因,以及反應(yīng)體系與程序進(jìn)行優(yōu)化篩選、深入研究,研制了水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測方法標(biāo)準(zhǔn);再次對轉(zhuǎn)基因水稻的篩選元件進(jìn)行統(tǒng)計分析,建立了轉(zhuǎn)基因水稻篩查檢測方法,構(gòu)建了檢測用陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒;最后成功研制了轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),為檢測提供物質(zhì)基礎(chǔ)。這些結(jié)果為我國轉(zhuǎn)基因水稻安全評價與管理、標(biāo)識制度的實(shí)施,以及監(jiān)管檢測提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。本研究我們?nèi)〉玫闹饕晒缦?1.研發(fā)了一種新型植物種子... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：152 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品PCR檢測策略示意圖及特異性情況

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文18混合機(jī)、水分測定儀等，且對設(shè)備和操作環(huán)境的要求也比較高，因此生產(chǎn)成本較昂貴[131,132]。3.1.2質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（plasmidreferencematerial）是指由含有轉(zhuǎn)基因檢測外源目的基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性片段的重組質(zhì)粒分子制備形成的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[133]。它的優(yōu)點(diǎn)有可以通過微生物培養(yǎng)而無限復(fù)制，制備過程相對簡單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，對制備操作環(huán)境要求不高，生產(chǎn)成本較低；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不需要再抽提DNA，使用方便，且均勻性好、純度高；可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測，因?yàn)橐粋�質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可以包含多個轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的外源目的片段，可以同時對多個轉(zhuǎn)化體進(jìn)行檢測[134-136]。缺點(diǎn)是只能用于基于核酸的檢測方法；質(zhì)粒分子的DNA與待測樣品的基因組DNA的基質(zhì)差異，可能會導(dǎo)致兩者的PCR擴(kuò)增效率不一致，進(jìn)而導(dǎo)致定量結(jié)果的誤差，因此測定結(jié)果需要校正系數(shù)（CoefficientValues,CVs）來校正；對于溫度、濃度、時間等儲存條件較敏感，相對不穩(wěn)定[137]。3.1.3基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一類來自于轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物葉片基因組DNA，用于轉(zhuǎn)基因植物定性和定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)�；蚪MDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)其特點(diǎn)是相對于其它標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)如基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來說制備容易；在定量檢測過程中不需要額外的校正系數(shù)。缺點(diǎn)是對原材料要求嚴(yán)格，很多品系因沒有批準(zhǔn)商業(yè)化，原材料供給有限；而且它需要提取大量的DNA，耗費(fèi)大量的人力。圖2轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值轉(zhuǎn)化應(yīng)用示意圖Fig.2StrategydiagramofGMOPCRdetectionandthedetectionspecificity

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文28（7）棄上清，加入500μL，5mL、5mL70％乙醇溶液洗滌，12000r/min離心10min。（8）棄上清，將離心管倒立于吸水紙吸干，并使乙醇充分揮發(fā)，干燥DNA；加50μL水溶解DNA。DNA溶液-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.11不同水稻種子粒度對DNA提取質(zhì)量的影響本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了改良CTAB法、Qiagen、Tiangen試劑盒三種提取方法來提取不同粒度水稻種子DNA。分別用電泳法和紫外分光光度計法，測定DNA的質(zhì)量。1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.3.1過柱緩沖液pH值優(yōu)化結(jié)果過柱緩沖液pH值分別為4.0，4.5,5.0,5.5,6.0,6.5和7.0時，玉米、水稻、棉花和大豆種子的DNA提取得率見圖3至圖6可得，過柱緩沖液pH值為5.0-6.0時，DNA得率較高、質(zhì)量較好，其中，當(dāng)過柱緩沖液pH值為5.5時,DNA得率不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它pH的得率，而且DNA的純度也最高。因此，為了達(dá)到更好的效果，過柱緩沖液pH值優(yōu)選為5.5。圖3過柱緩沖液不同pH值下玉米種子的DNA得率Fig.3DNAyieldofmaizeseedsatdifferentpHvaluesincolumn-crossingbuffer圖4過柱緩沖液不同pH值下水稻種子的DNA得率Fig.4DNAyieldofriceseedsatdifferentpHvaluesincolumn-crossingbuffer

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3599620