剛地弓形蟲是一種頂復門原蟲,其感染宿主非常廣泛。研究表明弓形蟲在寄生過程中,不僅能夠調(diào)節(jié)宿主基因的表達,而且還可以改變自身的代謝等生物過程以適應不同的寄生環(huán)境。弓形蟲與宿主的互作研究主要以模式動物小鼠為主,然而越來越多的證據(jù)表明不同宿主感染弓形蟲后的病原-宿主互作機制不盡相同。豬是弓形蟲的易感宿主,感染后導致母豬流產(chǎn)、死胎等,造成巨大的經(jīng)濟損失。然而目前關(guān)于豬與弓形蟲互作的研究還非常有限。本研究以豬肺泡巨噬細胞（3D4/21）為宿主細胞,選取弓形蟲Me49蟲株作為代表蟲株,利用Dual RNA-seq技術(shù)進行互作轉(zhuǎn)錄組分析。我們的結(jié)果揭示了豬肺泡巨噬細胞感染弓形蟲后獨特的應答反應,同時我們還發(fā)現(xiàn)弓形蟲適應胞內(nèi)寄生生活的代謝途徑并對其中兩個（II型脂肪酸合成與磷酸鹽的吸收）在蟲體生長繁殖中生理功能進行了研究,主要內(nèi)容如下:（1）互作轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析對獲得的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)分析表明豬肺泡巨噬細胞感染弓形蟲以后蟲體與宿主的轉(zhuǎn)錄譜均發(fā)生顯著改變,豬肺泡巨噬細胞中上調(diào)基因主要與免疫應答相關(guān),下調(diào)基因主要集中在細胞連接。對差異表達基因進行細致分析揭示了豬巨噬細胞與小鼠巨噬細胞響應弓形蟲感染的差別。II... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：127 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語表
1 文獻綜述
    1.1 弓形蟲生活史
    1.2 弓形蟲的危害
    1.3 抗弓形蟲感染的免疫應答研究
    1.4 弓形蟲對宿主細胞的入侵與修飾
    1.5 弓形蟲免疫逃避機制
    1.6 弓形蟲在宿主細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運研究
        1.6.1 弓形蟲脂肪酸代謝研究
        1.6.2 弓形蟲轉(zhuǎn)運蛋白研究
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 蟲株、細胞和菌株
        3.1.3 載體與質(zhì)粒
        3.1.4 引物
    3.2 主要儀器與試劑
        3.2.1 主要儀器
        3.2.2 主要試劑盒
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 主要試劑的配制
    3.3 實驗方法
        3.3.1 細胞傳代培養(yǎng)
        3.3.2 細胞及蟲株的凍存及復蘇
        3.3.3 互作轉(zhuǎn)錄組測序樣品的收集
        3.3.4 轉(zhuǎn)錄組樣品文庫構(gòu)建及測序
        3.3.5 測序數(shù)據(jù)分析
        3.3.6 基因組DNA提取方法
        3.3.7 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.3.8 熒光定量q RT-PCR分析轉(zhuǎn)錄組差異基因
        3.3.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.3.10 質(zhì)粒提取
        3.3.11 切膠回收目的DNA片段
        3.3.12 CRISPR/Cas9 質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.13 具有同源臂重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.14 弓形蟲基因敲除蟲株的構(gòu)建
        3.3.15 間接免疫熒光
        3.3.16 弓形蟲復制實驗
        3.3.17 空斑實驗
        3.3.18 弓形蟲入侵檢測
        3.3.19 弓形蟲逸出檢測
        3.3.20 CCCP抑制劑對弓形蟲體外生長影響的檢測
        3.3.21 小鼠毒力實驗
        3.3.22 荷蟲量檢測
        3.3.23 酵母試驗
4 結(jié)果與分析
    4.1 互作轉(zhuǎn)錄組測序及分析
        4.1.1 獲得高質(zhì)量的RNA樣品
        4.1.2 獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)
        4.1.3 測序序列具有較高的比對率
        4.1.4 生物學重復樣品間具有較高的相關(guān)性
        4.1.5 差異基因分析及驗證
        4.1.6 豬肺泡巨噬細胞感染弓形蟲前后差異表達基因功能分析
        4.1.7 弓形蟲適應細胞內(nèi)寄生的潛在機制分析
    4.2 Tg Fab D基因的敲除及功能研究
        4.2.1 FabD在弓形蟲進入宿主細胞后表達升高
        4.2.2 Tg Fab D敲除蟲株的構(gòu)建
        4.2.3 ΔFabD表型分析
    4.3 弓形蟲磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白功能研究
        4.3.1 弓形蟲編碼3個潛在的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白
        4.3.2 弓形蟲磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白進化分析揭示不同的保守性
        4.3.3 弓形蟲磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白生物信息學分析
        4.3.4 弓形蟲磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的定位研究
        4.3.5 弓形蟲磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的敲除/敲低
        4.3.6 弓形蟲磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因敲除/敲低蟲株表型分析
        4.3.7 獲得PiT2回補蟲株
        4.3.8 PiT2回補蟲株表型實驗
        4.3.9 CCCP抑制弓形蟲在體外的生長
        4.3.10 利用重組酵母實驗驗證弓形蟲磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的活性
5 討論
    5.1 轉(zhuǎn)錄組學在宿主-病原互作中的應用研究
    5.2 豬肺泡巨噬細胞與弓形蟲互作轉(zhuǎn)錄組研究
        5.2.1 樣品制備與測序
        5.2.2 互作轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析揭示豬肺泡巨噬細胞獨特的應答反應
        5.2.3 弓形蟲進入宿主細胞前后差異表達基因功能分析
    5.3 FASⅡ脂肪酸合成途徑在弓形蟲中的生理功能
    5.4 弓形蟲磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白對弓形蟲在體內(nèi)外生長具有關(guān)鍵作用
6 結(jié)論
參考文獻
致謝
附錄 A
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]國內(nèi)豬、牛和雞弓形蟲感染情況及危險因素研究進展[J]. 鄭斌,李金娜.  中國動物檢疫. 2016(03)
[3]干擾素誘導的GTP酶及其在抗感染先天免疫系統(tǒng)中的作用[J]. 張艷,葉向群.  生命的化學. 2008(05)
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本文編號：3451095