雞傳染性法氏囊�。↖BD）是一種嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的疾病,該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為重要家禽疫病之一。1990年以后,IBD的防控局勢發(fā)生了巨大改變,不同毒力的傳染性法氏囊病病毒（IBDV）毒株開始出現(xiàn)。超強毒（vvIBDV）主要在我國流行,導致炎癥、免疫抑制及幼雞的高死亡率。研究IBDV的致病機制,找到防控重點,對于疾病防治具有重要意義。目前對于IBDV具體致病機制的研究仍不全面,本研究主要從IBDV病毒吸附及致炎機理兩個方面,對IBDV致病機制進行進一步探索。病毒感染的第一個步驟就是與受體結合并進入細胞,目前已知IBDV VP2蛋白是決定病毒與細胞結合及細胞嗜性的主要病毒蛋白。為了找到IBDV可能受體,并更深入的了解IBDV復制過程,本實驗通過質(zhì)譜檢測IBDV衣殼蛋白VP2的互作蛋白,篩選到膜蛋白CD74分子。免疫共沉淀實驗驗證了CD74胞外區(qū)與VP2的互作,并驗證了CD74對于IBDV復制能力及吸附作用的影響。通過Western blot、qPCR及ELD₅₀實驗結果可見,病毒在CD74敲低細胞系中復制減弱,而CD74過表達則促進IBDV的復制。激... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

VP2互作蛋白質(zhì)譜結果

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第二章IBDV吸附受體CD74的鑒定22Microscope）進行觀察，利用ZEN2software導出圖片。2.1.12CD74敲低細胞系的構建慢病毒包裝由上海吉瑪公司完成，shRNA序列為sense5′-GCGAUGAGAACGGUGACUATT-3′,antisense5′-UAGUCACCGUUCUCAUCGCTT-3′。DT40細胞感染慢病毒，感染后的細胞利用流式分選系統(tǒng)（MoFloXDP）進行紅色熒光（RFP）分眩慢病毒轉(zhuǎn)導陽性細胞率通過熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測，敲低效率由WesternBlot與qPCR檢測。2.2結果2.2.1篩選CD74作為IBDV受體疑似分子之前的研究結果表明IBDV衣殼蛋白VP2對于病毒與細胞互作及抗原性具有重要作用。為了篩選可能的受體分子，本實驗利用免疫沉淀實驗進行VP2互作蛋白篩選，將銀染得到的VP2及陰性對照差異條帶送質(zhì)譜測序。結果如圖2-1所示。一系列VP2疑似互作蛋白被檢測到，其中包括CD74分子。圖2-1VP2互作蛋白質(zhì)譜結果Figure2-1LC/MSresultsforproteininteractedwithVP2為了進一步確認VP2與CD74胞外區(qū)的互作，利用免疫共沉淀實驗檢測CD74胞外區(qū)與vvIBDVGx毒株及HLJ0405毒株VP2蛋白的互作，結果如圖2-2所示，正反拉結果表明CD74與vvIBDVVP2具有相互作用。圖2-2CD74與VP2相互作用Figure2-2Co-ipresultsforCD74andIBDVVP2

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第二章IBDV吸附受體CD74的鑒定23為了檢測CD74在雞體內(nèi)的分布，利用qPCR實驗檢測了SPF雞心臟、脾臟、肺臟、肝臟、腎臟、胸腺及法氏囊中CD74的轉(zhuǎn)錄情況，結果如2-3所示，CD74在IBDV靶器官法氏囊中轉(zhuǎn)錄水平最高。圖2-3雞CD74臟器分布Figure2-3DistributionforchickenCD74為了探索CD74在IBDV感染后的上調(diào)，將SPF接種vvIBDV，感染后12、24、36h收集法氏囊進行CD74轉(zhuǎn)錄水平檢測，如圖2-4所示，CD74在IBDV感染后12h相對于非感染組明顯上調(diào)（P＜0.05）。圖2-4IBDV感染后CD74mRNA變化情況Figure2-4mRNAlevelofchickenCD74aftervvIBDVinfection2.2.2CD74下調(diào)抑制IBDV復制為了檢測CD74是否參與IBDV感染過程，將CD74Ii-2亞型在DT40細胞中下調(diào)表達，24h后感染1MOIvvIBDV，感染后24、48和72h收集細胞上清及沉淀進行病毒復制水平檢測。WesternBlot結果可見CD74干擾后DT40細胞中CD74表達水平下調(diào)（圖2-5）。WesternBlot結果表明CD74下調(diào)減弱IBDV復制，可見VP2表達在感染后24~48h下降（圖2-6）。qPCR結果表明，CD74下調(diào)表達使IBDV拷貝數(shù)在感染后48h下降6.34倍（圖2-7，P＜0.05），同時IBDVELD50滴度下降14.0倍（圖2-8，P＜0.05），與干擾陰性對照相比。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]雞傳染性法氏囊病的流行與防控[J]. 王笑梅.  北方牧業(yè). 2013(22)
[2]減毒沙門氏菌為載體在Vero細胞中表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因[J]. 李龍,方維煥,樊擁軍,許健,方立,李建榮,于漣.  生物工程學報. 2004(03)
[3]雞傳染性法氏囊病超強毒毒株的分離和初步鑒定[J]. 李德山,武志強,陳冠春,王笑梅,谷守林,郝桂玉,尹訓南.  中國畜禽傳染病. 1991(06)
[4]北京地區(qū)雞傳染性法氏囊病病原分離[J]. 周蛟,劉福致,陳麗永,王淑娟.  中國獸醫(yī)雜志. 1982(07)



本文編號：3375482