雞傳染性法氏囊�。↖BD）是一種嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的疾病,該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為重要家禽疫病之一。1990年以后,IBD的防控局勢(shì)發(fā)生了巨大改變,不同毒力的傳染性法氏囊病病毒（IBDV）毒株開始出現(xiàn)。超強(qiáng)毒（vvIBDV）主要在我國(guó)流行,導(dǎo)致炎癥、免疫抑制及幼雞的高死亡率。研究IBDV的致病機(jī)制,找到防控重點(diǎn),對(duì)于疾病防治具有重要意義。目前對(duì)于IBDV具體致病機(jī)制的研究仍不全面,本研究主要從IBDV病毒吸附及致炎機(jī)理兩個(gè)方面,對(duì)IBDV致病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探索。病毒感染的第一個(gè)步驟就是與受體結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞,目前已知IBDV VP2蛋白是決定病毒與細(xì)胞結(jié)合及細(xì)胞嗜性的主要病毒蛋白。為了找到IBDV可能受體,并更深入的了解IBDV復(fù)制過程,本實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)譜檢測(cè)IBDV衣殼蛋白VP2的互作蛋白,篩選到膜蛋白CD74分子。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CD74胞外區(qū)與VP2的互作,并驗(yàn)證了CD74對(duì)于IBDV復(fù)制能力及吸附作用的影響。通過Western blot、qPCR及ELD₅₀實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,病毒在CD74敲低細(xì)胞系中復(fù)制減弱,而CD74過表達(dá)則促進(jìn)IBDV的復(fù)制。激... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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VP2互作蛋白質(zhì)譜結(jié)果

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文第二章IBDV吸附受體CD74的鑒定22Microscope）進(jìn)行觀察，利用ZEN2software導(dǎo)出圖片。2.1.12CD74敲低細(xì)胞系的構(gòu)建慢病毒包裝由上海吉瑪公司完成，shRNA序列為sense5′-GCGAUGAGAACGGUGACUATT-3′,antisense5′-UAGUCACCGUUCUCAUCGCTT-3′。DT40細(xì)胞感染慢病毒，感染后的細(xì)胞利用流式分選系統(tǒng)（MoFloXDP）進(jìn)行紅色熒光（RFP）分眩慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)陽(yáng)性細(xì)胞率通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)，敲低效率由WesternBlot與qPCR檢測(cè)。2.2結(jié)果2.2.1篩選CD74作為IBDV受體疑似分子之前的研究結(jié)果表明IBDV衣殼蛋白VP2對(duì)于病毒與細(xì)胞互作及抗原性具有重要作用。為了篩選可能的受體分子，本實(shí)驗(yàn)利用免疫沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行VP2互作蛋白篩選，將銀染得到的VP2及陰性對(duì)照差異條帶送質(zhì)譜測(cè)序。結(jié)果如圖2-1所示。一系列VP2疑似互作蛋白被檢測(cè)到，其中包括CD74分子。圖2-1VP2互作蛋白質(zhì)譜結(jié)果Figure2-1LC/MSresultsforproteininteractedwithVP2為了進(jìn)一步確認(rèn)VP2與CD74胞外區(qū)的互作，利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD74胞外區(qū)與vvIBDVGx毒株及HLJ0405毒株VP2蛋白的互作，結(jié)果如圖2-2所示，正反拉結(jié)果表明CD74與vvIBDVVP2具有相互作用。圖2-2CD74與VP2相互作用Figure2-2Co-ipresultsforCD74andIBDVVP2

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文第二章IBDV吸附受體CD74的鑒定23為了檢測(cè)CD74在雞體內(nèi)的分布，利用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SPF雞心臟、脾臟、肺臟、肝臟、腎臟、胸腺及法氏囊中CD74的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果如2-3所示，CD74在IBDV靶器官法氏囊中轉(zhuǎn)錄水平最高。圖2-3雞CD74臟器分布Figure2-3DistributionforchickenCD74為了探索CD74在IBDV感染后的上調(diào)，將SPF接種vvIBDV，感染后12、24、36h收集法氏囊進(jìn)行CD74轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，如圖2-4所示，CD74在IBDV感染后12h相對(duì)于非感染組明顯上調(diào)（P＜0.05）。圖2-4IBDV感染后CD74mRNA變化情況Figure2-4mRNAlevelofchickenCD74aftervvIBDVinfection2.2.2CD74下調(diào)抑制IBDV復(fù)制為了檢測(cè)CD74是否參與IBDV感染過程，將CD74Ii-2亞型在DT40細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，24h后感染1MOIvvIBDV，感染后24、48和72h收集細(xì)胞上清及沉淀進(jìn)行病毒復(fù)制水平檢測(cè)。WesternBlot結(jié)果可見CD74干擾后DT40細(xì)胞中CD74表達(dá)水平下調(diào)（圖2-5）。WesternBlot結(jié)果表明CD74下調(diào)減弱IBDV復(fù)制，可見VP2表達(dá)在感染后24~48h下降（圖2-6）。qPCR結(jié)果表明，CD74下調(diào)表達(dá)使IBDV拷貝數(shù)在感染后48h下降6.34倍（圖2-7，P＜0.05），同時(shí)IBDVELD50滴度下降14.0倍（圖2-8，P＜0.05），與干擾陰性對(duì)照相比。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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