microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)長(zhǎng)度約22 bp的內(nèi)源性小分子非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA因參與調(diào)控昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、免疫和抗藥性等諸多生理過程,近年來逐漸成為昆蟲發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis是一種危險(xiǎn)性的果蔬害蟲,寄主范圍廣,造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重,多個(gè)國(guó)家和地區(qū)將其列為檢疫性對(duì)象。目前,桔小實(shí)蠅已成為我國(guó)果蔬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的巨大威脅,探索桔小實(shí)蠅新的防控策略顯得尤為迫切。據(jù)此,本學(xué)位論文以桔小實(shí)蠅為研究對(duì)象,基于不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)變前后高通量測(cè)序,在注釋和鑒定miRNA的基礎(chǔ)上篩選差異表達(dá)的miRNA;利用qRT-PCR,解析卵和蛹期與發(fā)育相關(guān)的miRNA表達(dá)譜,同時(shí)結(jié)合使用miRNA類似物/抑制劑探究miRNA參與調(diào)控化蛹及羽化進(jìn)程的功能;最后聚焦miR-309a,綜合運(yùn)用qRT-PCR、靶基因預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀和外源激素處理等技術(shù)和方法,初步提出JH-miR-309a-pnr-Vg related genes通路調(diào)控桔小實(shí)蠅生殖的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:1桔... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：155 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

SmallRNAs文庫(kù)構(gòu)建流程圖（引自百邁客）

第二章桔小實(shí)蠅發(fā)育階段轉(zhuǎn)變前后miRNA鑒定19樣品原始reads低質(zhì)量reads含"N"reads短于18ntreads長(zhǎng)于18ntreads高質(zhì)量readsQ30百分比SamplesRaw_readsLow_qualityContaining"N"readsLength<18Length>30Clean_readsQ30(%)L1L-34922580500105977549384123768963998.52L2E-13942471700151683139522853395560198.69L2E-24275830801165869867135153438609498.85L2E-33975609302273478427094713431183698.63L2L-15064102400290930837622634396945398.57L2L-23447420400232292717850553036622298.66L2L-34756301200393120325129564111885398.6L3E-14610475700323344224731734039814298.67L3E-24476560200839512214525273491795398.68L3E-33594567800636720415301222804835298.64LW-14372527901699975611769373554858598.81LW-23757753902171204441740643169142998.65LW-34073745002192951528600023594793198.81PE-13257776800132611522743302897732398.82PE-23706400100241326321463173250442198.81PE-34045728002280955937530263389469398.71PL-14089681500218791832405993546829898.51PL-23782159000398331118490233198925698.19PL-34379396700623105923686763519423298.66AE-142821739001071573414718333063417298.85AE-24847092000245865030436194296865198.56AE-35086476700358787725971054467978598.59圖2.3桔小實(shí)蠅smallRNAs長(zhǎng)度和豐度分布Figure2.3LengthdistributionofsequencedsmallRNAsinB.dorsalis

西南大學(xué)博士學(xué)位論文22進(jìn)一步篩選（剔除無1個(gè)樣品reads大于100TPM的miRNA）和定量驗(yàn)證（7個(gè)miRNAs成功設(shè)計(jì)引物且相對(duì)表達(dá)量均高于1），7個(gè)桔小實(shí)蠅knownmiRNAs全部保留并進(jìn)行后續(xù)分析（表2.4）。其中，4個(gè)knownmiRNAs，包括bdo-miR-278、bdo-miR-987、bdo-miR-31b和bdo-miR-317序列高度保守，分別與黑腹果蠅、黑果蠅Drosophilavirilis和埃及伊蚊的相關(guān)序列完全一致；其他3個(gè)knownmiRNAs包括bdo-miR-311、bdo-miR-281和bdo-miR-285分別與黑腹果蠅的相關(guān)序列相差1至2個(gè)堿基（圖2.4）。綜合上述分析結(jié)果，測(cè)序共獲得83個(gè)桔小實(shí)蠅knownmiRNAs，其中79個(gè)將進(jìn)行后續(xù)分析。表2.4桔小實(shí)蠅knownmiRNA鑒定Table2.4IdentificationofknownmiRNAinB.dorsalisCt(template)，使用表達(dá)量最高階段作為模板的定量值；U6作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Ct值30經(jīng)2-ΔΔCt方法計(jì)算后的相對(duì)表達(dá)量為1。Ct(template),theqPCRvalueoftemplateusingthecDNAofthehighestexpressionstage;U6asreferencegenewasusedtonormalizetheexpressionofmiRNAsbytheanalysismethodof2-ΔΔCt;therelativeexpressionwas1by2-ΔΔCtmethodusingtheCtvalueof30.圖2.4桔小實(shí)蠅與其他物種miRNA序列比對(duì)鑒定到的7個(gè)knownmiRNA（A）miRNA序列高度保守，與近緣種完全一致。（B）miRNA序列與近緣種存在1至2個(gè)堿基差異。Figure2.4Identificationof7knownmiRNAsofB.dorsaliscomparedwithotherspecies(A)miRNAsequencesarehighlyconservative,andthesamesequencesintheclosespecies.(B)miRNAsequencehasoneortwomismatchescomparedwiththeclosespecies.miRNA名稱上游引物熔解（單峰）Ct值相對(duì)表達(dá)量miRNAnamePrimer-FMeltingcurve(singlepeak)Ct(template)Relativ


本文編號(hào)：3334908