本文關(guān)鍵詞：7種植物內(nèi)生和根際放線菌的分離鑒定及抗菌活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：放線菌是微生物天然產(chǎn)物的重要來源,已知約有22000種生物活性化合物來源于微生物,而其中45%是由放線菌產(chǎn)生的。但是隨著常規(guī)分離技術(shù)的不斷應(yīng)用,篩選得到新型抗生素的幾率不斷降低,而由于選擇性分離和遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展,從稀有放線菌中得到的抗生素數(shù)量逐年增加。在此背景下,鑒定那些尚未開發(fā)其合成天然產(chǎn)物潛力的生物資源可以提高發(fā)現(xiàn)新型菌株的可能性,而稀有放線菌的分離篩選,可能是現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目成功的關(guān)鍵。為了充分了解環(huán)境中微生物的多樣性,必須使用適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)。本研究選取了枸杞、地黃、白茅、紫花地丁、柴胡、凬草、黃連7種植物,利用選擇性分離方法,對其根及根際土壤進(jìn)行放線菌多樣性及活性化合物初步研究。(1)本研究對7種植物的根進(jìn)行干熱處理,對其根際土壤進(jìn)行離心富集,并選用抗菌藥物進(jìn)行放線菌的選擇性分離。從7種植物的根和根際土壤總共分離得到192株放線菌,形態(tài)學(xué)上大多屬于鏈霉菌屬和小單孢菌屬,其中類鏈霉菌約占分離菌株的60-70%,屬優(yōu)勢菌群;其中植物內(nèi)生菌70株,根際放線菌122株,除枸杞和白茅樣品外,其它植物的根際放線菌均多余內(nèi)生菌;各植物之間分離得到放線菌數(shù)目差別很大,在紫花地丁、地黃和白茅的根際土壤中分離得到較多的放線菌,且菌株形態(tài)各異;即使采自同一地域的樣品,分離得到的放線菌仍有很大差別;對部分菌株進(jìn)行16S r RNA基因測序,最終選取3株形態(tài)比較特異的菌株st1、st4和zh8進(jìn)行多相分類學(xué)鑒定,分別為野野村菌屬、放線產(chǎn)孢菌屬和小單孢菌屬的三株新種。(2)對篩選得到的菌株進(jìn)行抑細(xì)菌測定發(fā)現(xiàn),共20株菌對枯草芽孢桿菌或藤黃微球菌具有較好的抑制活性(抑菌直徑大于10mm):大部分有活性菌株為根際放線菌,僅gq1、gq12和sc6三株為內(nèi)生放線菌;gt9、ht2和st18對兩種細(xì)菌有較好的抑制作用,抑菌直徑達(dá)25mm以上。對篩選得到的菌株進(jìn)行抑真菌測定發(fā)現(xiàn),共16株放線菌發(fā)酵液的對兩種或兩種以上真菌具有較好抑制作用(抑菌直徑大于5mm),大部分仍為根際放線菌,僅gq1、gq12和hl7為內(nèi)生放線菌;gq1和gq12對大豆疫霉病菌具有很好的抑制活性,抑菌直徑達(dá)30mm以上,而st6、st14和dht1對所有真菌均具有抑制作用。菌株發(fā)酵液對細(xì)菌和真菌均有抑制作用的菌株有14株,僅對細(xì)菌有活性的菌株有6株(gt3、gt8、ht2、ht7、sc6、st18),僅對真菌有活性的菌株有2株(zt1和hl7)。在對峙實(shí)驗(yàn)中,共37株菌對兩種或兩種以上真菌具有較好活性(抑菌直徑大于2mm)。在十字交叉法測定中有活性的菌株在對峙法測定時均有活性;菌株對細(xì)菌和對真菌的活性之間沒有必然聯(lián)系。所有有活性菌株均為類鏈霉菌,其它菌株基本無活性,這可能是因?yàn)槠渌耆缧捂呔瓴划a(chǎn)氣生菌絲,在培養(yǎng)基上生長狀態(tài)比較弱,不利于抗生素的產(chǎn)生。(3)st14菌株對10種真菌具有廣譜抗性,通過16S r RNA基因測序,菌株st14與馬鈴薯瘡痂病致病菌Streptomyces scabies具有高達(dá)99.66%的相似性,對其進(jìn)行化合物分離。從st14菌株中分離得到的化合物與伴刀球霉素A(Concanamycins A)結(jié)構(gòu)相同。從鏈霉菌中分離得到新型抗生素的概率大大降低,而稀有放線菌的分離篩選仍然存在很多問題,稀有放線菌的不易培養(yǎng),使其化合物的分離受到嚴(yán)重制約,對稀有放線菌的研究仍然任重道遠(yuǎn)。(4)菌株st1的多相分類學(xué)鑒定:通過16S r RNA基因測序,菌株st1屬于野野村菌屬(Nonomuraea),與Nonomuraea rosea GW12687T(98.91%)、Nonomuraea solani NEAU-Z6T(98.44%)、Nonomuraea rhizophila YIM67092T(98.24%)和Nonomuraea monospora PT708T(98.02%)四株典型菌株具有最高的相似性,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株st1與其相似菌株形成獨(dú)立的分支。菌株st1與這四株野野村典型菌株在孢子形態(tài)、Na Cl耐受、部分生理生化實(shí)驗(yàn)和主要脂肪酸組成上均有很大不同,并且與相似菌株的DNA同源性均低于新菌鑒定的閾值70%,因此判斷菌株st1為野野村菌屬的一個新菌,命名為Nonomuraea shaanxiensis,典型菌株為NEAU-st1T,分別在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC 4.7096T)和德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM 45877T)進(jìn)行保藏。(5)菌株st4的多相分類學(xué)鑒定:16S r RNA基因測序顯示,菌株st4與Actinomycetospora rishiriensis RI109-Li102T(99.4%)、Actinomycetospora corticicola 014-5T(99.1%)、Actinomycetospora chiangmaiensis YIM 0006T(98.8%)和Actinomycetospora iriomotensis IR73-Li102T(98.2%)具有最高的相似性,但DNA-DNA同源分析將他們區(qū)分開來。菌株st4的化學(xué)分類學(xué)特征如肽聚糖氨基酸類型、全細(xì)胞水解物、優(yōu)勢甲基萘醌和磷酸類脂組成均支持菌株st4屬于產(chǎn)孢放線菌屬(Actinomycetospora)。但菌株st4在基內(nèi)菌絲上形成孢子囊,與其它典型菌株具有很大不同。Na Cl耐受和碳源利用等實(shí)驗(yàn)也證明菌株st4與其相似菌株不同。因此判斷菌株st4為產(chǎn)孢放線菌屬的一株新菌,命名為Actinomycetospora atypica,典型菌株為NEAU-st4T,分別在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC 4.7093T)和德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM 45873T)進(jìn)行保藏。(6)菌株zh8的多相分類學(xué)鑒定:16S r RNA基因相似性分析顯示,菌株zh8屬于小單孢菌屬(Micromonospora),與Micromonospora chokoriensis 2-19(6)T(99.9%)、Micromonospora saelicesensis Lupac 09T(99.3%)和Micromonospora lupini Lupac 14NT(99.0%)具有最高的相似性。gyr B基因分析也證明菌株zh8屬于小單孢菌屬。菌株zh8的磷脂類型包含雙磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇;全細(xì)胞水解糖含鼠李糖、木糖、葡萄糖和半乳糖;細(xì)胞壁氨基酸含Qg消旋-二氨基庚二酸和甘氨酸;菌株zh8的優(yōu)勢醌為MK-10(H4)、MK-10(H2)和MK-10(H6);菌株zh8的主要脂肪酸含有iso-C15:0、C16:0、C17:0。DNA-DNA雜交結(jié)果以及一些生理生化特征區(qū)分了菌株zh8與其相似菌株。因此判定菌株zh8為小單孢菌屬的一個新種,命名為Micromonospora violae,典型菌株為NEAU-zh8T,在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC 4.7102T)和德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM 45888T)進(jìn)行保藏。
【關(guān)鍵詞】：植物內(nèi)生菌 根際放線菌 活性化合物 多相分類學(xué) Nonomuraea shaanxiensis Actinomycetospora atypica Micromonospora violae
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S182
【目錄】：

• 摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 1 前言14-21
• 1.1 放線菌研究現(xiàn)狀14-15
• 1.2 選擇性分離方法15-17
• 1.2.1 濕熱和干熱處理16
• 1.2.2 選擇抗菌藥物16
• 1.2.3 離心16
• 1.2.4 其它方法16-17
• 1.3 從未被開發(fā)的資源中分離放線菌17-20
• 1.3.1 植物內(nèi)生菌18-19
• 1.3.2 極端環(huán)境19
• 1.3.3 海洋放線菌19-20
• 1.3.4 其它環(huán)境20
• 1.4 研究目的與意義20
• 1.5 課題來源20-21
• 2 材料與方法21-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品來源21
• 2.1.2 菌株來源21-22
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑23
• 2.2 主要培養(yǎng)基及配制方法23-25
• 2.2.1 分離培養(yǎng)基23
• 2.2.2 純化培養(yǎng)基23
• 2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基23-24
• 2.2.4 生測培養(yǎng)基24
• 2.2.5 液體培養(yǎng)基24
• 2.2.6 形態(tài)觀察培養(yǎng)基24-25
• 2.2.7 生理生化培養(yǎng)基25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法25-36
• 2.3.1 根際放線菌的分離25-26
• 2.3.2 植物根內(nèi)生放線菌的分離26
• 2.3.3 活性測定26-27
• 2.3.4 化合物分離27
• 2.3.5 多相分類學(xué)鑒定27-36
• 3 結(jié)果與分析36-70
• 3.1 篩選得到的菌株36-38
• 3.2 活性測定結(jié)果38-42
• 3.2.1 抑細(xì)菌活性測定結(jié)果38-39
• 3.2.2 抑真菌活性測定結(jié)果39-42
• 3.3 化合物分離結(jié)果42
• 3.4 放線菌新菌鑒定結(jié)果42-70
• 3.4.1 菌株st1多相分類學(xué)鑒定結(jié)果43-51
• 3.4.2 菌株st4多相分類學(xué)鑒定結(jié)果51-59
• 3.4.3 菌株zh8多相分類學(xué)鑒定結(jié)果59-70
• 4 討論70-72
• 4.1 分離材料的選擇70
• 4.2 選擇性分離方法70
• 4.3 放線菌的抑菌活性70-71
• 4.4 伴刀球霉素A71-72
• 5 結(jié)論72-73
• 致謝73-74
• 參考文獻(xiàn)74-81
• 附錄81-85
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文85-86

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本文編號：326113