本文關(guān)鍵詞：兩種重要魚類致病菌感染及減毒活疫苗接種途徑的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鰻弧菌是危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要魚類致病菌,可由黏膜組織進入魚體。隨著集約化養(yǎng)殖模式興起,由機械損傷、寄生蟲叮咬和腸炎等造成的黏膜損傷時有發(fā)生。目前,尚未有關(guān)于黏膜損傷對鰻弧菌感染影響的詳細報道。本研究首先利用qPCR技術(shù)考察了野生型致病性鰻弧菌MVM425浸泡感染斑馬魚后在黏膜組織處的定植情況,該菌可在腸道和皮膚中停留數(shù)小時并在皮膚中大量增殖。研究隨后建立皮膚和腸黏膜層損傷模型,考察了自然環(huán)境下黏膜損傷對鰻弧菌感染的影響。結(jié)果顯示,MVM425浸泡感染健康、皮膚和腸黏膜層受損斑馬魚的半數(shù)致死劑量(LD50)分別為106、103和106CFU/ml。利用免疫組化技術(shù)和qPCR技術(shù)進一步證實,皮膚黏膜層受損后,鰻弧菌可由皮膚損傷處突破魚體皮膚屏障,進而迅速增殖并導(dǎo)致內(nèi)臟出血,引起斑馬魚出現(xiàn)系統(tǒng)性弧菌病癥狀。因此,養(yǎng)殖過程中避免黏膜損傷尤其是皮膚黏膜層損傷對預(yù)防弧菌病十分重要。 接種疫苗是預(yù)防弧菌病暴發(fā)的有效手段之一。本實驗室利用無標記基因缺失技術(shù)成功構(gòu)建鰻弧菌減毒活疫苗MVAV6203,該菌浸泡接種大菱鲆和牙鲆可獲得良好免疫保護效果,但對其浸泡接種的進入途徑及其能否激發(fā)黏膜免疫應(yīng)答尚不了解。本研究首先利用qPCR技術(shù)和透射電鏡技術(shù)考察了疫苗浸泡接種后在斑馬魚各黏膜組織處的定植情況,疫苗在鰓組織中被迅速清除,在皮膚和腸道中可大量增殖,且在腸道中存留時間較久。電鏡結(jié)果顯示,鰓組織中僅0h時可見極少量疫苗菌體結(jié)構(gòu),皮膚黏膜層中3h時可見MVAV6203零星分布,而腸道中72h時仍可見MVAV6203樣細胞結(jié)構(gòu)存在。對黏膜組織免疫應(yīng)答相關(guān)基因進行考察,各黏膜組織均可依靠TLR5識別MVAV6203鞭毛結(jié)構(gòu),接種12h時腸道、皮膚和鰓組織中TLR5表達量分別上調(diào)4.7倍、7.4倍和3.8倍。此外,腸道中識別脂蛋白和脂多糖的TLR2和TLR4分別于接種24和48h上調(diào)表達1.3和1.6倍,并開啟MyD88依賴的信號通路,釋放IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a等細胞因子。病理分析證實接種后腸組織產(chǎn)生輕微炎癥反應(yīng),上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量自接種后6h顯著增加。因此,腸道是MVAV6203進入斑馬魚魚體及黏膜免疫應(yīng)答激發(fā)的主要場所。 MVAV6203浸泡免疫初期可由斑馬魚黏膜組織進入魚體并激發(fā)黏膜免疫應(yīng)答,但其激發(fā)局部免疫與系統(tǒng)免疫的應(yīng)答過程及二者聯(lián)系尚不清楚。本研究利用RT-qPCR技術(shù)考察了MVAV6203浸泡接種后激發(fā)斑馬魚局部黏膜組織及系統(tǒng)免疫器官的免疫應(yīng)答過程及效應(yīng)。免疫初期疫苗可刺激腎臟吞噬細胞增殖并表達TLR5,接種3d時TLR5和吞噬細胞細胞標志物b7r分別上調(diào)4.5倍和5.7倍,吞噬細胞隨后經(jīng)血液循環(huán)到達黏膜組織處行使識別和吞噬抗原功能,接種21d時皮膚TLR5和b7r表達量分別上調(diào)1.9倍和3.3倍。此外,脾臟和腎臟中MHC分子表達量在接種3d時分別上調(diào)1.7倍和5.5倍,腸道中MHC分子在接種7d時上調(diào)表達1.7倍,免疫接種21d時皮膚中MHC分子及CD4、CD8表達量均上調(diào)顯著,推測免疫細胞由系統(tǒng)免疫器官遷移至局部黏膜組織行使抗原遞呈功能。與Th1、Th2、Thl7和Threg分化相關(guān)的細胞因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分別于接種3d和14～21d在腎臟和皮膚、腸道中上調(diào)表達,說明分化成熟的T淋巴細胞先后遷移至系統(tǒng)免疫器官和局部黏膜組織行使細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外,疫苗接種可快速激活黏膜抗體IgZ介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答,免疫后期腎臟中IgM大量表達行使系統(tǒng)抗體介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答功能。因此,疫苗可激發(fā)局部免疫與系統(tǒng)免疫,且二者間存在免疫組分遷移現(xiàn)象。 經(jīng)浸泡和注射接種方式接種MVAV6203的魚體均可獲得良好免疫保護效果,但對兩種接種方式激發(fā)的免疫應(yīng)答過程尚不了解。本研究對比分析了疫苗以不同方式接種斑馬魚后激發(fā)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答過程。疫苗接種后均可在短時間內(nèi)激活免疫細胞對抗原的識別和遞呈過程,并最終增強免疫系統(tǒng)非特異性及特異性免疫防御能力,但注射方式較浸泡方式可更早產(chǎn)生細胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)；兩種接種方式均可在短時間內(nèi)激活抗體介導(dǎo)的體液免疫并最終產(chǎn)生系統(tǒng)抗體在黏膜組織處及黏膜抗體在系統(tǒng)免疫器官中介導(dǎo)的免疫效應(yīng),僅免疫效應(yīng)的時相存在差別,證實不同免疫策略可收獲相似的效應(yīng),為評價疫苗免疫效果奠定理論基礎(chǔ)。 除鰻弧菌外,遲鈍愛德華氏菌是又一危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的魚類致病菌。實驗室前期工作證實,經(jīng)高濃度遲鈍愛德華氏菌菌液浸泡的斑馬魚不易感,但黏膜損傷對該菌感染魚體的影響尚不清楚。本研究考察了黏膜損傷對遲鈍愛德華氏菌EIB202感染斑馬魚的影響。結(jié)果顯示,EIB202感染皮膚和腸黏膜層受損斑馬魚的LD50分別為107和105CFU/ml,證實腸黏膜受損是斑馬魚感染遲鈍愛德華氏菌的“誘導(dǎo)因素”之一,且感染程度與腸黏膜層受損程度有關(guān)。對健康及腸黏膜層受損斑馬魚感染EIB202后各組織炎癥相關(guān)細胞因子進行考察,發(fā)現(xiàn)該菌可引起腸黏膜層受損斑馬魚強烈炎癥反應(yīng),感染72h內(nèi)多種組織中IL-1β、TNF-α和iNOS表達量顯著上調(diào)。進一步研究證實,魚體炎癥反應(yīng)中釋放的抗菌物質(zhì)(如陽離子抗菌肽)可破壞斑馬魚腸固有菌群組成,以利于EIB202在腸道處定植。透射電鏡結(jié)果顯示,未被免疫系統(tǒng)清除的EIB202可在腸道中長期定植。因此,養(yǎng)殖過程通過控制慢性腸炎將有助于遲鈍愛德華氏菌病的防控。 綜上所述,斑馬魚皮膚和腸黏膜層受損分別是鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌感染魚體的“誘導(dǎo)因素”之一。腸道是鰻弧菌減毒活疫苗MVAV6203進入斑馬魚體內(nèi)并激發(fā)黏膜免疫應(yīng)答的主要場所,疫苗可激發(fā)局部免疫與系統(tǒng)免疫且二者間存在免疫組分遷移現(xiàn)象。疫苗注射和浸泡接種方式激發(fā)免疫應(yīng)答過程不同,但均可激發(fā)抗體和細胞介導(dǎo)的體液和細胞免疫。
【關(guān)鍵詞】：鰻弧菌 遲鈍愛德華氏菌 減毒活疫苗 斑馬魚 感染途徑 黏膜免疫應(yīng)答 系統(tǒng)免疫 局部免疫
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S941
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 文獻綜述14-34
• 1.1 水產(chǎn)養(yǎng)殖病害及疫苗14-18
• 1.1.1 鰻弧菌及弧菌病14-16
• 1.1.2 遲鈍愛德華氏菌及遲鈍愛德華氏菌病16-17
• 1.1.3 水產(chǎn)疫苗種類及遞送17-18
• 1.2 水產(chǎn)病害的感染途徑18-23
• 1.2.1 魚類黏膜組織結(jié)構(gòu)18-21
• 1.2.2 鰻弧菌感染魚體進入途徑的研究進展21-23
• 1.2.3 研究病原進入途徑的方法及意義23
• 1.3 魚類黏膜組織的先天免疫系統(tǒng)23-26
• 1.3.1 黏液23-24
• 1.3.2 體液免疫24-25
• 1.3.3 細胞免疫25-26
• 1.4 魚類黏膜組織的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)26-27
• 1.4.1 體液免疫26
• 1.4.2 細胞免疫26-27
• 1.5 魚類免疫應(yīng)答過程27-32
• 1.5.1 抗原識別27-29
• 1.5.2 炎癥反應(yīng)29-31
• 1.5.3 抗原加工及遞呈31
• 1.5.4 淋巴細胞活化31-32
• 1.5.5 黏膜免疫應(yīng)答與系統(tǒng)免疫應(yīng)答32
• 1.6 論文的主要內(nèi)容及意義32-34
• 第2章 黏膜損傷對鰻弧菌感染斑馬魚的影響34-55
• 2.1 引言34
• 2.2 實驗材料34-35
• 2.2.1 菌株及實驗動物34
• 2.2.2 藥品及儀器34-35
• 2.2.3 培養(yǎng)基及溶液配制35
• 2.3 實驗方法35-42
• 2.3.1 實驗動物馴養(yǎng)35-36
• 2.3.2 菌體培養(yǎng)及制備36
• 2.3.3 細菌質(zhì)粒抽提36-37
• 2.3.4 鰻弧菌感受態(tài)制備37
• 2.3.5 電轉(zhuǎn)37
• 2.3.6 鰻弧菌復(fù)壯37-38
• 2.3.7 定量檢測病原菌方法的建立38-39
• 2.3.8 斑馬魚黏膜組織損傷模型建立39
• 2.3.9 病原菌感染方式39
• 2.3.10 斑馬魚組織取樣39-40
• 2.3.11 細菌及動物組織基因組抽提40-41
• 2.3.12 免疫組織化學檢測41
• 2.3.13 黏液抑菌實驗41-42
• 2.4 實驗結(jié)果42-51
• 2.4.1 鰻弧菌毒株的復(fù)壯42
• 2.4.2 qPCR法定量檢測鰻弧菌模型建立42-43
• 2.4.3 不同接種方式鰻弧菌感染斑馬魚毒力考察43-44
• 2.4.4 鰻弧菌感染斑馬魚進入途徑考察44-46
• 2.4.5 鰻弧菌感染皮膚、腸黏膜層受損斑馬魚毒力考察46-48
• 2.4.6 鰻弧菌在健康和皮膚黏膜層損傷斑馬魚組織中的定植考察48-49
• 2.4.7 鰻弧菌感染皮膚損傷修復(fù)中的斑馬魚毒力考察49-51
• 2.4.8 斑馬魚皮膚黏液對鰻弧菌生長的抑制作用51
• 2.5 實驗討論51-54
• 2.6 本章小結(jié)54-55
• 第3章 鰻弧菌減毒活疫苗浸泡免疫斑馬魚的黏膜免疫應(yīng)答55-74
• 3.1 引言55
• 3.2 實驗材料55-56
• 3.2.1 菌株及實驗動物55
• 3.2.2 藥品及儀器55
• 3.2.3 培養(yǎng)基及溶液配制55-56
• 3.3 實驗方法56-59
• 3.3.1 斑馬魚浸泡免疫56
• 3.3.2 斑馬魚組織RNA抽提56-57
• 3.3.3 RNA消化、逆轉(zhuǎn)錄57
• 3.3.4 RT-qPCR57-58
• 3.3.5 病理組織樣品制備及分析58-59
• 3.3.6 透射電鏡樣品制備及分析59
• 3.4 實驗結(jié)果59-67
• 3.4.1 鰻弧菌減毒活疫苗浸泡接種斑馬魚進入途徑考察59-60
• 3.4.2 鰻弧菌減毒活疫苗在黏膜組織中的存留60-62
• 3.4.3 斑馬魚黏膜組織對鰻弧菌減毒活疫苗的識別62
• 3.4.4 斑馬魚黏膜組織對鰻弧菌減毒活疫苗的攝取62
• 3.4.5 浸泡接種后斑馬魚黏膜組織細胞因子的分泌表達62-67
• 3.4.6 浸泡接種后斑馬魚腸黏膜組織的炎癥反應(yīng)67
• 3.5 實驗討論67-71
• 3.6 本章小結(jié)71-74
• 第4章 鰻弧菌減毒活疫苗免疫斑馬魚激發(fā)的系統(tǒng)免疫與局部免疫74-83
• 4.1 引言74
• 4.2 實驗材料與方法74
• 4.3 實驗結(jié)果74-77
• 4.3.1 局部炥膜組織與系統(tǒng)免疫器官對減毒活疫苗的識別和攝取74
• 4.3.2 局部黏膜組織與系統(tǒng)免疫器官對減毒活疫苗的加工和遞呈74-75
• 4.3.3 局部黏膜組織與系統(tǒng)免疫器官浸泡接種后T細胞的增殖和分化75-76
• 4.3.4 局部黏膜組織與系統(tǒng)免疫器官浸泡接種后抗體分泌76-77
• 4.4 實驗討論77-82
• 4.5 本章小結(jié)82-83
• 第5章 鰻弧菌減毒活疫苗不同接種方式激發(fā)的免疫應(yīng)答83-94
• 5.1 引言83
• 5.2 實驗材料與方法83
• 5.3 實驗結(jié)果83-87
• 5.3.1 不同方式接種激發(fā)的免疫系統(tǒng)對減毒活疫苗的識別和攝取83-85
• 5.3.2 不同方式接種激發(fā)的免疫系統(tǒng)對減毒活疫苗的加工85
• 5.3.3 不同方式接種激發(fā)的免疫系統(tǒng)對減毒活疫苗的遞呈85-87
• 5.3.4 不同方式接種激發(fā)的抗體分泌87
• 5.4 實驗討論87-92
• 5.5 本章小結(jié)92-94
• 第6章 黏膜損傷對遲鈍愛德華氏菌感染斑馬魚的影響94-104
• 6.1 引言94
• 6.2 實驗材料94
• 6.3 實驗方法94-95
• 6.3.1 菌體培養(yǎng)及制備94-95
• 6.3.2 病原菌接種方式95
• 6.4 實驗結(jié)果95-99
• 6.4.1 不同接種方式遲鈍愛德華氏菌感染斑馬魚毒力考察95-97
• 6.4.2 感染遲鈍愛德華氏菌后斑馬魚各組織炎癥相關(guān)細胞因子的表達97
• 6.4.3 感染遲鈍愛德華氏菌后斑馬魚各組織抗菌反應(yīng)相關(guān)細胞因子的表達97
• 6.4.4 遲鈍愛德華氏菌在腸黏膜損傷斑馬魚腸道中的存留97-99
• 6.5 實驗討論99-102
• 6.6 本章小結(jié)102-104
• 第7章 主要結(jié)論和創(chuàng)新點104-107
• 7.1 主要結(jié)論104-105
• 7.2 創(chuàng)新點105
• 7.3 展望105-107
• 參考文獻107-122
• 攻讀博士學位期間撰寫的論文122-123
• 致謝123

【共引文獻】

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本文編號：321938