本文關(guān)鍵詞：茄科物種全基因組抗病基因鑒定及其進(jìn)化分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,近年來多個(gè)茄科物種的基因組數(shù)據(jù)相繼被釋放,這為全基因組范圍鑒定抗病基因和物種間比較基因組學(xué)的應(yīng)用提供了平臺(tái)。植物中大部分(80%)抗病基因?qū)儆贜BS-LRR類。本研究通過隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Model,HMM)和BLAST的方法從栽培番茄Heinz1706、野生番茄LA716、栽培馬鈴薯DM1-3、栽培辣椒Zunla-1、野生辣椒Chiltepin和栽培煙草TN90中分別鑒定出463、485、1,152、1,665、2,042和374個(gè)NBS-LRR類抗病基因。相比已報(bào)道的結(jié)果,本研究從番茄Heinz1706和馬鈴薯DM1-3中鑒定出69和397個(gè)新抗病基因。辣椒基因組內(nèi)(尤其是野生辣椒Chiltepin)的抗病基因數(shù)目在已報(bào)道的二倍體物種中是最大的。使用BLSATN的方法(E值為1e-10),我們將本研究從茄科物種鑒定出的絕大多數(shù)抗病基因(92%)劃分到了87個(gè)抗病基因亞家族中,其中16個(gè)亞家族為TIR-NBS-LRR(TNL)類,71個(gè)為non-TNL(n TNL)類。分析表明,TNL類抗病基因家族的基因結(jié)構(gòu)較n TNL類抗病基因亞家族的基因結(jié)構(gòu)更保守。本研究以番茄基因組的抗病基為對(duì)象構(gòu)建了147個(gè)VIGS沉默載體,覆蓋番茄Heinz1706中81個(gè)抗病基因亞家族的64個(gè),為未來番茄抗病基因的克隆提供了新的途徑。雖然茄科物種間抗病基因數(shù)目有巨大的差異(如野生辣椒Chiltepin中有2,042個(gè)抗病基因而栽培番茄Heinz1706只有463個(gè)),但是各個(gè)物種內(nèi)抗病基因亞家族的數(shù)目卻差不多(如野生辣椒Chiltepin和栽培番茄Heinz1706分別包含83和81個(gè)抗病基因亞家族)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),茄科物種間抗病基因數(shù)目的差異主要是由一些大的抗病基因亞家族造成,例如辣椒中22個(gè)大的抗病基因亞家族包含全基因組約80%的抗病基因,其中在辣椒Zunla-1和辣椒Chiltepin中最大的5個(gè)抗病基因亞家族(Rpi-blb2、BS2、SL-0273、Sw5-c和I2)分別包含832(50.0%)和1,027(50.3%)個(gè)抗病基因同源體,而這5個(gè)抗病基因亞家族在番茄Heinz1706、番茄LA716和煙草TN90卻只含有84(18.1%)、95(19.6%)和73(19.5%)個(gè)抗病基因同源體。辣椒中最大的兩個(gè)抗病基因亞家族(Rpi-blb2和BS2)在辣椒屬和茄屬內(nèi)所包含的抗病基因同源體數(shù)目相差巨大,例如BS2抗病基因亞家族在兩個(gè)辣椒基因組內(nèi)共包含626個(gè)同源體,但是在番茄和馬鈴薯內(nèi)只包含10個(gè)同源體。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)抗病基因亞家族的大部分同源體在茄科物種內(nèi)沒有序列交換,表明它們獨(dú)立進(jìn)化�？共』蛭稽c(diǎn)I2/R3在茄科內(nèi)是個(gè)抗病基因聚集的熱點(diǎn),很多抗病基因被定位在此位點(diǎn),其中包括番茄中的Ty-2、SM,馬鈴薯中的R3、R6和R7等和辣椒中的L。在本研究中,抗病基因Ty-2定位區(qū)間的一側(cè)被定位在標(biāo)記M-148200(51.63Mb)。該位點(diǎn)內(nèi)的I2抗病基因亞家族在番茄Heinz1706和馬鈴薯DM1-3內(nèi)分別包含36和71條同源體,數(shù)目相差近兩倍。這兩個(gè)基因組內(nèi)的大部分I2同源體都分布在11號(hào)染色體長(zhǎng)臂近端粒處的幾個(gè)Mb區(qū)域內(nèi)。根據(jù)該位點(diǎn)內(nèi)的I2同源體的分布,可以進(jìn)一步將該位點(diǎn)劃分成9個(gè)亞位點(diǎn),其中大部分的亞位點(diǎn)在兩個(gè)基因組內(nèi)所包含的I2同源體數(shù)目不同,而且有的亞位點(diǎn)還存在有和無(wú)的多態(tài)性。通過序列分析,我們發(fā)現(xiàn)番茄中的I2同源體有Type I和Type II兩種典型的進(jìn)化模型,但是馬鈴薯中的I2同源體卻沒有Type II類進(jìn)化模式。對(duì)該位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)、復(fù)制類型和進(jìn)化模型的了解可能為以后從該位點(diǎn)克隆抗病基因提供參考幫助。文獻(xiàn)報(bào)道馬鈴薯中的R3a(I2同源體)可以被mi R482切割,但是通過生物信息預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法,我們發(fā)現(xiàn)番茄內(nèi)的I2同源體可以被另一個(gè)mi RNAs(mi R6024)切割,并且可以產(chǎn)生21-nt的tasi RNAs。通過分析十個(gè)物種內(nèi)的mi R6024序列,我們推測(cè)mi R6024是茄科特有的mi RNA家族。綜上所述,本研究通過對(duì)茄科物種全基因組范圍內(nèi)抗病基因的鑒定、番茄抗病基因亞家族的劃分、抗病基因的進(jìn)化分析以及抗病基因VIGS沉默載體的構(gòu)建,為茄科抗性資源的利用以及抗病基因的快速克隆奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：茄科 抗病基因 比較基因組學(xué) 內(nèi)含子相位 miRNA
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S641
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略語(yǔ)表12-13
• 第一章 茄科物種全基因組范圍抗病基因的分析13-49
• 1.1 前言13-26
• 1.1.1 抗病基因的研究進(jìn)展13-20
• 1.1.1.1 抗病基因的克隆14
• 1.1.1.2 抗病基因的分類14-17
• 1.1.1.3 抗病基因的數(shù)量17-18
• 1.1.1.4 抗病基因的分布18-19
• 1.1.1.5 抗病基因的進(jìn)化19-20
• 1.1.2 比較基因組學(xué)在茄科中的應(yīng)用20-21
• 1.1.3 茄科抗病基因的研究21
• 1.1.4 病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）21-25
• 1.1.4.1 VIGS技術(shù)的作用機(jī)理22
• 1.1.4.2 VIGS載體的構(gòu)建和侵染22-23
• 1.1.4.3 VIGS技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)23-24
• 1.1.4.4 VIGS技術(shù)在植物抗病研究中的應(yīng)用24-25
• 1.1.5 本研究的目的與意義25-26
• 1.2 材料和方法26-31
• 1.2.1 原始基因組數(shù)據(jù)及軟件26-27
• 1.2.1.1 基因組數(shù)據(jù)26
• 1.2.1.2 軟件及在線工具26-27
• 1.2.2 茄科物種內(nèi)全基因組范圍抗病基因的鑒定27
• 1.2.3 抗病基因的注釋和分類27-28
• 1.2.4 抗病基因亞家族的劃分及N端保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)28-29
• 1.2.5 抗病基因的進(jìn)化分析29
• 1.2.6 抗病基因的有/無(wú)多態(tài)性分析29
• 1.2.7 抗病基因綜合圖譜的構(gòu)建29-30
• 1.2.8 VIGS載體的構(gòu)建及侵染流程30-31
• 1.3 結(jié)果和分析31-45
• 1.3.1 茄科物種內(nèi)抗病基因的數(shù)目31-32
• 1.3.2 茄科抗病基因亞家族的劃分32-33
• 1.3.3 茄科抗病基因亞家族的進(jìn)化分析33-36
• 1.3.4 兩類抗病基因亞家族（TNL和n TNL）內(nèi)含子特征的多態(tài)性36-37
• 1.3.5 茄科物種間抗病基因數(shù)目差別的原因37-38
• 1.3.6 抗病基因亞家族（Rpi-blb2和BS2）在茄科中的綜合分析38-42
• 1.3.6.1 Rpi-blb2抗病基因亞家族38-40
• 1.3.6.2 BS2抗病基因亞家族40-42
• 1.3.7 茄科抗病基因的綜合圖42-43
• 1.3.8 番茄中VIGS載體的構(gòu)建43-45
• 1.4 討論45-49
• 1.4.1 茄科物種抗病基因的重新鑒定45
• 1.4.2 四個(gè)科（茄科、十字花科、葫蘆科和禾本科）的大部分抗病基因（>85%）可以被劃分到茄科 87 個(gè)抗病基因亞家族45-46
• 1.4.3 抗病基因亞家族在四個(gè)科內(nèi)的進(jìn)化46-47
• 1.4.4 茄科物種間抗病基因數(shù)目的差異主要是由幾個(gè)大的抗病基因亞家族造成的47
• 1.4.5 結(jié)論與展望47-49
• 第二章 I2抗病基因位點(diǎn)的進(jìn)化研究以及I2同源體與mi RNAs的互作49-77
• 2.1 前言49-54
• 2.1.1 番茄黃化曲葉病及抗病基因簡(jiǎn)介49-50
• 2.1.1.1 番茄黃化曲葉病49-50
• 2.1.1.2 番茄黃化曲葉病抗性基因50
• 2.1.2 I2/R3抗病基因位點(diǎn)的研究進(jìn)展50-51
• 2.1.3 Mi RNA51-52
• 2.1.3.1 Mi RNA簡(jiǎn)介51
• 2.1.3.2 Mi RNA基因的典型特征51-52
• 2.1.3.3 22-nt mi RNAs切割靶基因后可誘導(dǎo)產(chǎn)生 21-nt的tasi RNAs52
• 2.1.4 Mi RNAs與抗病基因的互作52-53
• 2.1.5 本研究的目的及意義53-54
• 2.2 材料與方法54-60
• 2.2.1 原始基因組數(shù)據(jù)及軟件54-55
• 2.2.1.1 基因組數(shù)據(jù)54
• 2.2.1.2 軟件及在線工具54-55
• 2.2.3 番茄材料55-56
• 2.2.4 鑒定各基因型對(duì)番茄黃化曲葉病的抗性56
• 2.2.5 引物設(shè)計(jì)和標(biāo)記開發(fā)56
• 2.2.6 I2同源體的獲得56-57
• 2.2.6.1 通過PCR技術(shù)獲得I2同源體56-57
• 2.2.6.2 其他來源的I2同源體57
• 2.2.7 抗病基因Ty-2 和I2同源體的定位57-58
• 2.2.7.1 抗病基因Ty-2 的定位57-58
• 2.2.7.2 定位基因型T和t中的I2同源體58
• 2.2.8 預(yù)測(cè)并驗(yàn)證與I2同源體互作的mi RNAs58-60
• 2.2.8.1 預(yù)測(cè)與I2同源體互作的mi RNAs58-59
• 2.2.3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi RNAs與I2同源體互作59-60
• 2.3 結(jié)果與分析60-73
• 2.3.1 抗病基因Ty-2 的定位60
• 2.3.2 I2/R3位點(diǎn)在番茄和馬鈴薯基因組中的結(jié)構(gòu)60
• 2.3.3 I2/R3位點(diǎn)在番茄和馬鈴薯中的比較分析60-64
• 2.3.4 不同基因型對(duì)TYLCV抗性的檢測(cè)及基因組內(nèi)I2同源體的獲得64-65
• 2.3.5 紅小麗基因型T和t中I2同源體的定位65
• 2.3.6 I2抗病基因亞家族在番茄中的進(jìn)化模式65-67
• 2.3.7 偶爾發(fā)生的組間序列交換有一定的方向性67-68
• 2.3.8 I2抗病基因亞家族在馬鈴薯中的進(jìn)化模式68-69
• 2.3.9 鑒定調(diào)控I2同源體的mi RNAs69-70
• 2.3.10 Mi R6024切割I(lǐng)2同源體可產(chǎn)生次級(jí)s RNAs70-71
• 2.3.11 Mi R6024為茄科特有的mi RNA家族71-73
• 2.4 討論73-77
• 2.4.1 茄科物種內(nèi)I2抗病基因位點(diǎn)的多態(tài)性73-74
• 2.4.2 抗病基因位點(diǎn)I2在基因型T和LA1777中的結(jié)構(gòu)不同74
• 2.4.3 I2同源體間的序列交換74-75
• 2.4.4 Mi RNAs調(diào)控I2同源體的表達(dá)75-76
• 2.4.5 結(jié)論與展望76-77
• 參考文獻(xiàn)77-88
• 附錄88-105
• 附表1 第一章的附表88-92
• 附表 1-1 部分物種內(nèi)抗病基因的數(shù)目88
• 附表 1-2 87個(gè)抗病基因亞家族在茄科物種內(nèi)包含的同源體個(gè)數(shù)88-91
• 附表 1-3 茄屬8個(gè)非全長(zhǎng)BS2同源體在辣椒中的最好匹配序列91-92
• 附表2 第二章的附表92-96
• 附表 2-1 本研究中的通過PCR擴(kuò)增和NCBI下載的I2同源體92-95
• 附表 2-2 本研究中的引物序列95-96
• 附錄1 實(shí)驗(yàn)步驟及體系96-101
• 附1.1 基因組DNA小樣抽提法96
• 附1.2 PCR體系及程序96-97
• 附1.3 PCR產(chǎn)物回收97
• 附1.4 PCR產(chǎn)物和載體雙酶切97-98
• 附1.5 連接98
• 附1.6 TA克隆98
• 附1.7 質(zhì)粒的抽提98-99
• 附1.8 電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)制備99
• 附1.9 電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌99-100
• 附1.10 VIGS侵染步驟100-101
• 附錄2 RNA抽提及 5′RACE步驟101-104
• 附2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的TYLCV侵染101
• 附2.2 Trizol法抽提植物總RNA101
• 附2.3 植物RNA的純化101-102
• 附2.4 5′RACE步驟102-104
• 附錄3 作者簡(jiǎn)介104-105
• 致謝105-107

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