銅作為一種必需的微量元素,在生物體生長發(fā)育中具有著重要的功能,包括參與多種酶的激活、血漿銅藍蛋白的合成、膠原蛋白的合成等。因此銅在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡會導(dǎo)致很多疾病和發(fā)育缺陷,如貧血、周圍神經(jīng)病等。由于銅(包括Cu20NPs和Cu²⁺)在生產(chǎn)生活中被廣泛應(yīng)用,由此造成環(huán)境中銅污染問題已經(jīng)十分嚴重,而銅污染會對魚類及人類的健康造成不良影響。目前已經(jīng)有大量的研究評估了銅對水生生物的影響,例如我們的早期研究也發(fā)現(xiàn)銅會造成斑馬魚胚胎發(fā)育畸形,包括脊柱彎曲變短、眼睛變小、運動功能受損等。然而有關(guān)銅造成胚胎發(fā)育缺陷相關(guān)分子和遺傳機制的研究仍然較少。本研究以模式生物斑馬魚為研究對象,通過對剛受精的斑馬魚胚胎進行銅暴露,運用蘇木素和伊紅染色（hematoxylin-eosin20staining,H&E）、透射電鏡（transmission20electron20microscope,TEM）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、整體原位雜交（whole20mount20in20situ20hybridization,WISH）、熒光定量PCR（RT-PCR）、免疫熒光（immuno... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：126 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 銅的研究綜述
        1.2.1 銅的生物學(xué)功能
        1.2.2 生物體內(nèi)銅代謝
        1.2.3 銅與疾病的發(fā)生
    1.3 斑馬魚眼部發(fā)育與疾病
        1.3.1 斑馬魚眼睛的主要結(jié)構(gòu)
        1.3.2 斑馬魚眼睛的早期發(fā)育
        1.3.3 與視網(wǎng)膜有關(guān)的疾病發(fā)生
    1.4 斑馬魚腸道的發(fā)育與疾病
        1.4.1 腸的主要結(jié)構(gòu)
        1.4.2 斑馬魚腸的早期發(fā)育
        1.4.3 與腸有關(guān)的疾病發(fā)生
    1.5 斑馬魚血管的發(fā)育與疾病
        1.5.1 斑馬魚血管發(fā)育
        1.5.2 血管相關(guān)疾病的產(chǎn)生
    1.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
        1.6.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)機制
        1.6.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細胞凋亡
        1.6.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與疾病的發(fā)生
    1.7 活性氧(Reactive oxygen species)與氧化應(yīng)激
        1.7.1 活性氧與氧化應(yīng)激的產(chǎn)生
        1.7.2 氧化應(yīng)激與細胞凋亡
        1.7.3 氧化應(yīng)激與疾病的發(fā)生
    1.8 foxm1功能的相關(guān)研究
    1.9 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗對象
        2.1.2 所用載體、菌株和抗體
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 主要實驗試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 銅溶液制備
        2.2.2 斑馬魚胚胎銅暴露
        2.2.3 濁點萃取
        2.2.4 電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)
        2.2.5 透射電子顯微鏡技術(shù)(TEM)
        2.2.6 斑馬魚組織冰凍切片
        2.2.7 冰凍切片H&E染色
        2.2.8 免疫熒光染色
        2.2.9 RNA抽提
        2.2.10 總cDNA的合成
        2.2.11 熒光定量PCR
        2.2.12 基因芯片分析表達譜(Microarray)
        2.2.13 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)
        2.2.14 DNA純化回收
        2.2.15 探針質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.16 反義mRNA探針的合成
        2.2.17 胚胎整體原位雜交
        2.2.18 胚胎總蛋白的提取
        2.2.19 Western blot分析
        2.2.20 細胞凋亡檢測(TUNEL)
        2.2.21 細胞的培養(yǎng)與傳代
        2.2.22 細胞的凍存及復(fù)蘇
        2.2.23 細胞銅暴露
        2.2.24 細胞遷移與劃痕修復(fù)實驗
        2.2.25 胚胎顯微注射
        2.2.26 統(tǒng)計學(xué)分析
3 實驗結(jié)果
    3.1 銅脅迫與斑馬魚胚胎發(fā)育
        3.1.1 銅脅迫胚胎中銅顆粒和銅離子的定量
        3.1.2 銅脅迫下斑馬魚胚胎差異表達基因
        3.1.3 納米銅和銅離子脅迫的斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)錄表達分析
    3.2 銅對斑馬魚胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育的影響
        3.2.1 銅脅迫下斑馬魚胚胎眼的發(fā)育情況
        3.2.2 銅脅迫下視網(wǎng)膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平
        3.2.3 銅脅迫下斑馬魚胚胎視錐、視桿細胞蛋白表達水平
        3.2.4 銅脅迫下斑馬魚胚胎視網(wǎng)膜細胞凋亡和增殖
        3.2.5 銅脅迫斑馬魚胚胎中氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
        3.2.6 抗氧化劑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激拮抗劑可以挽救斑馬魚視網(wǎng)膜的缺陷表型
        3.2.7 銅脅迫對cox17~(-/-)突變體斑馬魚視網(wǎng)膜發(fā)育的影響
        3.2.8 銅脅迫對atp7a~(-/-)突變體斑馬魚視網(wǎng)膜發(fā)育的影響
    3.3 銅對斑馬魚胚胎腸發(fā)育的影響
        3.3.1 銅脅迫對斑馬魚胚胎腸結(jié)構(gòu)的影響
        3.3.2 銅脅迫下調(diào)斑馬魚腸相關(guān)基因的表達
        3.3.3 銅脅迫斑馬魚胚胎腸細胞中氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
        3.3.4 抗氧化劑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激拮抗劑可以挽救腸的缺陷表型
        3.3.5 銅脅迫對cox17~(-/-)突變體斑馬魚腸道發(fā)育的影響
        3.3.6 銅脅迫對atp7a~(-/-)突變體斑馬魚腸道發(fā)育的影響
    3.4 銅對斑馬魚血管生成的影響
        3.4.1 銅脅迫對斑馬魚胚胎體節(jié)間血液循環(huán)的影響
        3.4.2 銅對斑馬魚胚胎中血管生成相關(guān)基因表達的影響
        3.4.3 foxm1敲降對斑馬魚胚胎血管的影響
        3.4.4 foxm1敲降對斑馬魚胚胎血管生成相關(guān)基因表達的影響
        3.4.5 銅對HUVECs細胞遷移的影響
4 討論
    4.1 銅脅迫與斑馬魚胚胎發(fā)育
        4.1.1 銅及納米銅對生物體具有明顯的毒性效應(yīng)
        4.1.2 納米銅誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷主要通過其釋放的銅離子
    4.2 銅脅迫造成斑馬魚視網(wǎng)膜和腸道發(fā)育缺陷的分子機理
        4.2.1 銅脅迫斑馬魚胚胎視網(wǎng)膜和腸道發(fā)育缺陷
        4.2.2 銅誘導(dǎo)斑馬魚胚胎產(chǎn)生氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
        4.2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激是造成視網(wǎng)膜和腸道缺陷的主要原因
        4.2.4 COX17和ATP7A功能缺失部分阻斷銅脅迫造成的視網(wǎng)膜和腸畸形
    4.3 銅脅迫造成斑馬魚血管發(fā)育缺陷的分子機理
        4.3.1 銅通過影響血管出芽造成體節(jié)間血管缺陷
        4.3.2 銅通過下調(diào)foxm1誘導(dǎo)斑馬魚體節(jié)血管發(fā)育缺陷
5 總結(jié)
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3176344