機體被流感病毒感染后可引起呼吸系統(tǒng)不同程度的損傷。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示,季節(jié)性流感病毒（A型H1N1和H3N2流感病毒,以及B型流感病毒）每年在全球范圍內(nèi)造成大約300萬至500萬例重癥病例和29萬至65萬人死亡。此外,禽流感病毒H5N1和H7N9,已具備了人畜共患特征。隨著季節(jié)變化和生態(tài)改變,常引起跨物種傳播,最終導致新型流感病毒株的大流行,造成無數(shù)人感染。世界衛(wèi)生組織每年召開兩次流感疫苗組份推薦會（一次針對北半球,另一次針對南半球）,試圖根據(jù)流行病毒的基因和抗原特征以及各國的流行病學信息來選擇正確的疫苗。由于疫苗株是在每個流行季之前6個月左右確定的,偶爾會出現(xiàn)候選疫苗株和流行毒株之間抗原不匹配。因此,需要做好準備應(yīng)對新型流感病毒。m RNA疫苗可以用作一種應(yīng)對新發(fā)突發(fā)傳染病的應(yīng)急疫苗,而且相比傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒活疫苗等其他類型疫苗具有許多優(yōu)勢。為此,本文主要開展流感病毒m RNA疫苗的制備與實驗免疫研究。1. 季節(jié)性流感病毒的分離與鑒定由于季節(jié)性流感病毒的持續(xù)進化,使它們能夠逃脫先前感染或接種疫苗引起的免疫。因此,本研究選擇在流感病毒流行季節(jié)的高峰期2018.12.28～20... 

【文章來源】：軍事科學院北京市

【文章頁數(shù)】：112 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
縮略語表
摘要
Abstract
前言
第一章 季節(jié)性流感病毒的分離與鑒定
    1.1 材料
        1.1.1 咽拭子樣本
        1.1.2 主要試劑
        1.1.3 儀器設(shè)備
        1.1.4 SPF級雞胚
        1.1.5 引物合成
        1.1.6 分子生物學分析軟件
    1.2 方法
        1.2.1 咽拭子樣本處理
        1.2.2 流感病毒RT-PCR鑒定
        1.2.3 目的基因的純化與克隆
        1.2.4 SPF級雞胚接種與尿囊液收取
        1.2.5 雞血紅細胞凝集試驗
50)測定">        1.2.6 分離株半數(shù)致死量(LD₅₀)測定
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 咽拭子樣本分類
        1.3.2 流感病毒PCR鑒定
        1.3.3 流感病毒的分離
        1.3.4 分離株與同年WHO推薦候選疫苗株HA基因比對分析
50)測定">        1.3.5 分離株A/Jilin/JYT-01/2018（H1N1）半數(shù)致死量(LD₅₀)測定
    1.4 討論
    1.5 小結(jié)
第二章 RNA候選疫苗體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的構(gòu)建與篩選
    2.1 材料
        2.1.1 細菌、質(zhì)粒、細胞與流感病毒株
        2.1.2 抗體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 儀器設(shè)備
        2.1.5 溶液配制
        2.1.6 分子生物學分析軟件
    2.2 方法
        2.2.1 三種體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的構(gòu)建及功能驗證
        2.2.2 重組質(zhì)粒p GEM-EGFP-n1/n2/n3及p GEM-H3N2-HA-n1/n2/n3 構(gòu)建
        2.2.3 重組質(zhì)粒大量制備
        2.2.4 重組質(zhì)粒線性化
        2.2.5 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.2.6 mRNA加帽反應(yīng)
        2.2.7 Cap-m RNA純化
        2.2.8 Cap-m RNA體外細胞轉(zhuǎn)染試驗
        2.2.9 流式細胞術(shù)測定EGFP陽性細胞率
        2.2.10 免疫印跡試驗（Western Blot）
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 目的基因EGFP和 H3N2-HA的擴增
        2.3.2 重組質(zhì)粒p GEM-EGFP-n1/n2/n3及p GEM-H3HA-n1/n2/n3 的線性化處理
        2.3.3 體外轉(zhuǎn)染Cap-m RNA-n1/n2/n3 效果評價
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 mRNA候選疫苗脂質(zhì)體納米材料的制備及功能驗證
    3.1 材料
        3.1.1 抗體
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 儀器設(shè)備
        3.1.4 溶液配制
        3.1.5 實驗動物
    3.2 方法
        3.2.1 脂質(zhì)體納米顆粒LNP和 LNP-Man的制備
        3.2.2 透射電子顯微鏡觀察
        3.2.3 LNPs/m RNA的制備
        3.2.4 脂質(zhì)體納米顆粒粒徑及電位測定
        3.2.5 凝膠阻滯試驗
        3.2.6 細胞毒性檢測
        3.2.7 體外細胞轉(zhuǎn)染效果評價
        3.2.8 體外刺激小鼠樹突狀細胞成熟
        3.2.9 重組質(zhì)粒p GEM-Luc-n3 的構(gòu)建
        3.2.10 動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果評價
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 脂質(zhì)體納米顆粒理化性質(zhì)測定
        3.3.2 LNPs/m RNA體外細胞轉(zhuǎn)染效果評價
        3.3.3 LNPs/m RNA動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果評價
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 A型 H1N1、H5N1和B型流感病毒m RNA候選疫苗構(gòu)建及實驗免疫研究
    4.1 材料
        4.1.1 抗體
        4.1.2 毒株
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 A型 H1N1、H5N1及B型流感病毒m RNA候選疫苗的構(gòu)建策略
        4.2.2 引物設(shè)計與合成
        4.2.3 三株流感病毒HA基因擴增及純化
        4.2.4 三組重組質(zhì)粒p GEM-HA-n3 構(gòu)建與鑒定
        4.2.5 三組Cap-m HA-n3 制備
        4.2.6 三組Cap-m HA-n3 功能驗證
        4.2.7 三組流感病毒LNPs/m RNA疫苗的制備及免疫策略
50)測定">        4.2.8 A型 H5N1和B型流感病毒株半數(shù)致死量(LD₅₀)測定
        4.2.9 血凝抑制效價測定
        4.2.10 血清中總Ig G、Ig G1、Ig G2a抗體水平檢測
        4.2.11 血清中IL-4、IFN-γ細胞因子水平檢測
        4.2.12 小鼠脾淋巴細胞分離及T細胞亞群鑒定
        4.2.13 小鼠肺組織病理切片制備
        4.2.14 小鼠體重和存活率測定
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 三組重組質(zhì)粒p GEM-HA-n3 構(gòu)建、鑒定及線性化處理
        4.3.2 三組Cap-m HA-n3 制備及功能驗證
50)測定">        4.3.3 攻毒株半數(shù)致死量(LD₅₀)測定
        4.3.4 血凝抑制效價測定
        4.3.5 血清中總Ig G、Ig G1、Ig G2a抗體水平檢測
        4.3.6 血清中IL-4、IFN-γ細胞因子水平檢測
        4.3.7 T淋巴細胞亞群檢測
        4.3.8 攻毒后小鼠肺組織病理切片觀察
        4.3.9 攻毒后小鼠體重和存活率測定
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
參考文獻
作者在學期間取得的學術(shù)成果
主要簡歷
致謝



本文編號：3159783