機(jī)體被流感病毒感染后可引起呼吸系統(tǒng)不同程度的損傷。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示,季節(jié)性流感病毒（A型H1N1和H3N2流感病毒,以及B型流感病毒）每年在全球范圍內(nèi)造成大約300萬(wàn)至500萬(wàn)例重癥病例和29萬(wàn)至65萬(wàn)人死亡。此外,禽流感病毒H5N1和H7N9,已具備了人畜共患特征。隨著季節(jié)變化和生態(tài)改變,常引起跨物種傳播,最終導(dǎo)致新型流感病毒株的大流行,造成無(wú)數(shù)人感染。世界衛(wèi)生組織每年召開(kāi)兩次流感疫苗組份推薦會(huì)（一次針對(duì)北半球,另一次針對(duì)南半球）,試圖根據(jù)流行病毒的基因和抗原特征以及各國(guó)的流行病學(xué)信息來(lái)選擇正確的疫苗。由于疫苗株是在每個(gè)流行季之前6個(gè)月左右確定的,偶爾會(huì)出現(xiàn)候選疫苗株和流行毒株之間抗原不匹配。因此,需要做好準(zhǔn)備應(yīng)對(duì)新型流感病毒。m RNA疫苗可以用作一種應(yīng)對(duì)新發(fā)突發(fā)傳染病的應(yīng)急疫苗,而且相比傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒活疫苗等其他類型疫苗具有許多優(yōu)勢(shì)。為此,本文主要開(kāi)展流感病毒m RNA疫苗的制備與實(shí)驗(yàn)免疫研究。1. 季節(jié)性流感病毒的分離與鑒定由于季節(jié)性流感病毒的持續(xù)進(jìn)化,使它們能夠逃脫先前感染或接種疫苗引起的免疫。因此,本研究選擇在流感病毒流行季節(jié)的高峰期2018.12.28～20... 

【文章來(lái)源】：軍事科學(xué)院北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
摘要
Abstract
前言
第一章 季節(jié)性流感病毒的分離與鑒定
    1.1 材料
        1.1.1 咽拭子樣本
        1.1.2 主要試劑
        1.1.3 儀器設(shè)備
        1.1.4 SPF級(jí)雞胚
        1.1.5 引物合成
        1.1.6 分子生物學(xué)分析軟件
    1.2 方法
        1.2.1 咽拭子樣本處理
        1.2.2 流感病毒RT-PCR鑒定
        1.2.3 目的基因的純化與克隆
        1.2.4 SPF級(jí)雞胚接種與尿囊液收取
        1.2.5 雞血紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)
50)測(cè)定">        1.2.6 分離株半數(shù)致死量(LD₅₀)測(cè)定
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 咽拭子樣本分類
        1.3.2 流感病毒PCR鑒定
        1.3.3 流感病毒的分離
        1.3.4 分離株與同年WHO推薦候選疫苗株HA基因比對(duì)分析
50)測(cè)定">        1.3.5 分離株A/Jilin/JYT-01/2018（H1N1）半數(shù)致死量(LD₅₀)測(cè)定
    1.4 討論
    1.5 小結(jié)
第二章 RNA候選疫苗體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的構(gòu)建與篩選
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)菌、質(zhì)粒、細(xì)胞與流感病毒株
        2.1.2 抗體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 儀器設(shè)備
        2.1.5 溶液配制
        2.1.6 分子生物學(xué)分析軟件
    2.2 方法
        2.2.1 三種體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的構(gòu)建及功能驗(yàn)證
        2.2.2 重組質(zhì)粒p GEM-EGFP-n1/n2/n3及p GEM-H3N2-HA-n1/n2/n3 構(gòu)建
        2.2.3 重組質(zhì)粒大量制備
        2.2.4 重組質(zhì)粒線性化
        2.2.5 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.2.6 mRNA加帽反應(yīng)
        2.2.7 Cap-m RNA純化
        2.2.8 Cap-m RNA體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
        2.2.9 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定EGFP陽(yáng)性細(xì)胞率
        2.2.10 免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 目的基因EGFP和 H3N2-HA的擴(kuò)增
        2.3.2 重組質(zhì)粒p GEM-EGFP-n1/n2/n3及p GEM-H3HA-n1/n2/n3 的線性化處理
        2.3.3 體外轉(zhuǎn)染Cap-m RNA-n1/n2/n3 效果評(píng)價(jià)
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 mRNA候選疫苗脂質(zhì)體納米材料的制備及功能驗(yàn)證
    3.1 材料
        3.1.1 抗體
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 儀器設(shè)備
        3.1.4 溶液配制
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    3.2 方法
        3.2.1 脂質(zhì)體納米顆粒LNP和 LNP-Man的制備
        3.2.2 透射電子顯微鏡觀察
        3.2.3 LNPs/m RNA的制備
        3.2.4 脂質(zhì)體納米顆粒粒徑及電位測(cè)定
        3.2.5 凝膠阻滯試驗(yàn)
        3.2.6 細(xì)胞毒性檢測(cè)
        3.2.7 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)
        3.2.8 體外刺激小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞成熟
        3.2.9 重組質(zhì)粒p GEM-Luc-n3 的構(gòu)建
        3.2.10 動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 脂質(zhì)體納米顆粒理化性質(zhì)測(cè)定
        3.3.2 LNPs/m RNA體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)
        3.3.3 LNPs/m RNA動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 A型 H1N1、H5N1和B型流感病毒m RNA候選疫苗構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究
    4.1 材料
        4.1.1 抗體
        4.1.2 毒株
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 A型 H1N1、H5N1及B型流感病毒m RNA候選疫苗的構(gòu)建策略
        4.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
        4.2.3 三株流感病毒HA基因擴(kuò)增及純化
        4.2.4 三組重組質(zhì)粒p GEM-HA-n3 構(gòu)建與鑒定
        4.2.5 三組Cap-m HA-n3 制備
        4.2.6 三組Cap-m HA-n3 功能驗(yàn)證
        4.2.7 三組流感病毒LNPs/m RNA疫苗的制備及免疫策略
50)測(cè)定">        4.2.8 A型 H5N1和B型流感病毒株半數(shù)致死量(LD₅₀)測(cè)定
        4.2.9 血凝抑制效價(jià)測(cè)定
        4.2.10 血清中總Ig G、Ig G1、Ig G2a抗體水平檢測(cè)
        4.2.11 血清中IL-4、IFN-γ細(xì)胞因子水平檢測(cè)
        4.2.12 小鼠脾淋巴細(xì)胞分離及T細(xì)胞亞群鑒定
        4.2.13 小鼠肺組織病理切片制備
        4.2.14 小鼠體重和存活率測(cè)定
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 三組重組質(zhì)粒p GEM-HA-n3 構(gòu)建、鑒定及線性化處理
        4.3.2 三組Cap-m HA-n3 制備及功能驗(yàn)證
50)測(cè)定">        4.3.3 攻毒株半數(shù)致死量(LD₅₀)測(cè)定
        4.3.4 血凝抑制效價(jià)測(cè)定
        4.3.5 血清中總Ig G、Ig G1、Ig G2a抗體水平檢測(cè)
        4.3.6 血清中IL-4、IFN-γ細(xì)胞因子水平檢測(cè)
        4.3.7 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)
        4.3.8 攻毒后小鼠肺組織病理切片觀察
        4.3.9 攻毒后小鼠體重和存活率測(cè)定
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
作者在學(xué)期間取得的學(xué)術(shù)成果
主要簡(jiǎn)歷
致謝



本文編號(hào)：3159783