豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的母豬繁殖障礙與呼吸困難、仔豬肺炎、生長遲緩、免疫抑制、死亡率增加等癥狀的高度傳染性疾病,目前缺乏有效的疫苗及商品化的抗病毒藥物。Nsp9具有病毒RNA依賴的RNA聚合酶活性,是病毒形成轉(zhuǎn)錄和復(fù)制復(fù)合體的核心組件,可作為研發(fā)抗PRRSV制劑的理想靶標(biāo)。本團隊前期已經(jīng)從駱駝體內(nèi)篩選出了抗PRRSV Nsp9的納米抗體Nb6,并驗證了胞內(nèi)表達Nb6的Marc-145細(xì)胞系感染PRRSV能力下降;連接細(xì)胞穿膜肽TAT的Nb6能夠有效進入PRRSV易感細(xì)胞,并抑制不同基因型PRRSV復(fù)制。然而,細(xì)胞穿膜肽穿膜的隨機性,提示Nb6靶向易感細(xì)胞的入胞途徑仍需改進。由于PRRSV具備嚴(yán)格的單核巨噬細(xì)胞趨向性,在感染時,首先在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中復(fù)制。單核巨噬細(xì)胞高表達Fcγ受體,該類受體是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞作用的主要受體�；谝陨媳尘�,本研究設(shè)計并表達了融合豬Ig G Fc的嵌合抗體Nb6-p Fc,使其能靶向PRRSV易感的豬單核... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻綜述
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征研究進展
        1.1.1 PRRSV概述
        1.1.2 PRRSV的感染特點及防控
        1.1.3 抗PRRSV納米抗體的研發(fā)
    1.2 納米抗體及應(yīng)用情景
        1.2.1 納米抗體的結(jié)構(gòu)特點
        1.2.2 納米抗體的優(yōu)點
        1.2.3 納米抗體的應(yīng)用
    1.3 巨噬細(xì)胞FcγR及其介導(dǎo)的內(nèi)吞作用
        1.3.1 FcγRs的分類
        1.3.2 巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞
        1.3.3 FcγR在PRRSV感染上的研究進展
    1.4 本研究的目的及意義
第二章 豬Fcγ鏈接的嵌合抗體表達及活性驗證
    2.1 試驗材料
        2.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒與菌株
        2.1.2 主要試劑耗材
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 畢赤酵母表達重組質(zhì)粒p PICZαA-Nb6-pFc的構(gòu)建
        2.2.2 陽性Nb6-pFc、Nb53-pFc畢赤酵母X-33 表達菌株的篩選
        2.2.3 Nb6-pFc在畢赤酵母X-33 中的誘導(dǎo)表達及初步鑒定
        2.2.4 Nb6-pFc的純化、濃縮及活性鑒定
    2.3 試驗結(jié)果
        2.3.1 pPICZαA-Nb6-pFc畢赤酵母表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.2 陽性Nb6-pFc、Nb53-pFc畢赤酵母X-33 表達菌株的篩選
        2.3.3 Nb6-pFc、Nb53-pFc的誘導(dǎo)表達及鑒定
        2.3.4 Nb6-pFc的純化、濃縮及活性鑒定
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 Nb6-pFc通過FcγR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細(xì)胞
    3.1 試驗材料
        3.1.1 細(xì)胞和病毒
        3.1.2 主要試劑耗材
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 試驗方法
        3.2.1 初步檢測Nb6-pFc能夠進入含有FcγR的細(xì)胞
        3.2.2 不同濃度Nb6-pFc進入PAM檢測
        3.2.3 不同時間Nb6-pFc進入PAM檢測
        3.2.4 Nb6-pFc的細(xì)胞毒性檢測
    3.3 試驗結(jié)果
        3.3.1 IFA檢測Nb6-pFc進入PAM和 BMDC細(xì)胞
        3.3.2 不同濃度Nb6-pFc進入PAM的檢測
        3.3.3 不同時間Nb6-pFc進入PAM的檢測
        3.3.4 Nb6-pFc的細(xì)胞毒性檢測
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 Nb6-pFc抗 PRRSV功能研究
    4.1 試驗材料
        4.1.1 病毒
        4.1.2 主要試劑耗材
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 試驗方法
        4.2.1 Nb6-pFc對 rSD16/TRS2/clover在 PAM上復(fù)制的影響
        4.2.2 Nb6-pFc對 PRRSV高致病性GD-HD在 PAM上復(fù)制的影響
    4.3 試驗結(jié)果
        4.3.1 Nb6-pFc抑制rSD16/TRS2/clover在 PAM細(xì)胞上的復(fù)制
        4.3.2 Nb6-pFc抑制GD-HD在 PAM上的復(fù)制
        4.3.3 Nb6-pFc引起PAM細(xì)胞因子的表達
        4.3.4 Nb6-pFc能夠抑制PRRSV不同毒株在PAM上的復(fù)制
        4.3.5 Nb6-pFc分多次給藥能夠提高對rSD16/TRS2/clover在 PAM上的抑制率
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 穩(wěn)定表達Nb6-pFc懸浮293細(xì)胞系的構(gòu)建
    5.1 試驗材料
        5.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒
        5.1.2 主要試劑耗材
        5.1.3 主要儀器
    5.2 試驗方法
        5.2.1 pLvx-sp-Nb6-pFc-IRES-Zs Green表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.2 慢病毒的包裝
        5.2.3 慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)293s細(xì)胞
        5.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清表達產(chǎn)物的鑒定
        5.2.5 熒光陽性細(xì)胞的分選及擴大培養(yǎng)
    5.3 試驗結(jié)果
        5.3.1 pLvx-sp-Nb6-pFc-IRES-Zs Green表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.3.2 慢病毒包裝
        5.3.3 293s細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達的Nb6-pFc具有良好的生物學(xué)活性
        5.3.4 分選后Nb6-pFc的293s熒光觀察
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
全文結(jié)論
創(chuàng)新點及下一步研究方向
參考文獻
附錄 基本緩沖液配制
致謝
個人簡歷



本文編號：3153093