本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯晚疫病菌RxLR效應蛋白與寄主蛋白互作促進侵染的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：馬鈴薯晚疫病(Potato Late Blight)由致病疫霉菌P.infestans引起,該病害在適宜的環(huán)境條件下能快速發(fā)展造成病害流行,是一種毀滅性的卵菌病害。生產(chǎn)上,防控馬鈴薯晚疫病最有效的手段是種植抗病品種,但是由于該病病原菌P.infestans不斷發(fā)生毒性變異,經(jīng)常導致作物品種抗性的喪失,病害呈周期性流行和爆發(fā)。在晚疫病菌侵染寄主的過程中,該病原菌與寄主發(fā)生互作,植物體產(chǎn)生免疫反應,這包括復雜的交叉-結(jié)合的信號傳輸網(wǎng)和信號調(diào)節(jié)過程。植物誘導防御的第一個階段包括對保守微生物分子的認知(病原菌相關(guān)分子模式;PAMPs),或者由于細胞的損傷而產(chǎn)生的分子(DAMPs)的識別,導致防御通道的激活,這一過程被稱為跨膜識別受體觸發(fā)的防衛(wèi)反應(PTI)。寄主的特異性病原物則逐步地操縱和抑制PTI,來提高植物感病性。效應蛋白(Effector),是植物病原微生物在與寄主植物互作過程中分泌的、可被植物NBS-LRR抗性蛋白特異識別、兼具毒性與無毒性功能的蛋白,是病原物用于抑制PTI的策略之一。因此,鑒定效應蛋白及與它們互作的寄主靶蛋白,以及研究效應蛋白操縱寄主使植物感病機制是當前研究的一個重點。本論文以致病疫霉菌(Phytophthora infestans)分泌的定位在細胞核上的重要效應蛋白PexRD41為研究對象,該效應蛋白的基因地址是04089,因此本研究通稱PITG_04089(Pi04089),獲得的研究結(jié)果如下:(1)通過在Pi04089基因序列的N端融合綠色熒光蛋白GFP,介導農(nóng)桿菌后轉(zhuǎn)染模式植物本氏煙,接種馬鈴薯晚疫病菌,與對照GFP空載體相比,顯著促進了馬鈴薯晚疫病的侵染。借助共聚焦熒光顯微鏡Confocal進行活體觀察,確定了PITG_04089蛋白顯著地定位于細胞核,在細胞核核仁周圍形成一個環(huán)。被測RxLR效應蛋白PITG_04089(Pi04089)基因表達量在晚疫病菌侵染的早期階段(24h和48h)出現(xiàn)顯著的基因上調(diào),這種上調(diào)作用甚至可以持續(xù)到72h。(2)為了驗證核仁在Pi04089行使功能中的作用,本研究在GFP-040894 N端加入出核信號NES,形成NESGFP-Pi04089融合蛋白,經(jīng)confocal觀察,GFP綠色熒光蛋白在細胞核仁中顯著減少,同時細胞質(zhì)中的綠色熒光顯著增強,說明該信號將GFP-Pi04089極大地運出細胞核。在本氏煙上進行ATTA實驗,瞬時表達GFP-Pi04089和NESGFP-Pi04089后接種晚疫病菌,病斑測量值進行方差實驗,結(jié)果顯示與GFP-Pi04089相比,修飾后的NESGFP-Pi04089顯著地降低了晚疫病菌的侵染水平,大大削弱了效應蛋白Pi04089對晚疫病的侵染,表明細胞核是Pi04089在植物體內(nèi)實現(xiàn)功能的重要部位。(3)為了篩選Pi04089在植物體內(nèi)的互作靶蛋白,實驗室構(gòu)建了馬鈴薯晚疫病菌酵母雙雜交庫,cDNA文庫材料來自于P.infestans侵染15h和72h的馬鈴薯植株病組織,從酵母雙雜交系統(tǒng)中篩選到Pi04089在寄主中的靶蛋白為含3個KH結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白KRBP1(命名為StKRBP1)。此外,通過免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù),也驗證了StKRBP1與Pi04089在植物體內(nèi)的互作關(guān)系。(4)通過雙分子熒光互補(BiFC)技術(shù),發(fā)現(xiàn)Pi04089與KRBP1互作發(fā)生在細胞核內(nèi),免疫印跡western blotting實驗證實了這些蛋白組合在植物中穩(wěn)定存在。當Pi04089與KRBP1在本氏煙共表達(co-expression)時,Pi04089原先在細胞核核仁的環(huán)消失,定位因KRBP1的存在而改變,該效應蛋白定位到與KRBP1相同的細胞核核斑點上。在兩者共表達植株上接種晚疫病菌,發(fā)現(xiàn)在病原菌早期侵染階段(24h),KRBP1蛋白表達量顯著提高,因此證明了KRBP1對晚疫病菌侵染起正調(diào)節(jié)的作用。(5)利用病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術(shù),將KHRBPs的保守基序GxxG突變?yōu)镚DDG,構(gòu)建了2個VIGS突變體StKRBP1mut。通過酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù),證明該突變體與Pi04089在酵母和植物體內(nèi)不再互作。突變體阻止了Pi04089在核斑點上的定位,StKRBP1mut蛋白表達量也沒有增加。(6)突變體StKRBP1mut不再幫助晚疫病菌提高對葉片的侵染,這表明核苷酸結(jié)合位點對效應蛋白Pi04089與KRBP1互作是必要的。研究結(jié)果顯示KRBP1是一個感病因子(Susceptibility Factor),效應蛋白Pi04089可能修飾或增強了KRBP1的活性,與KRBP協(xié)作提高病原菌侵染。
【關(guān)鍵詞】：馬鈴薯晚疫病 致病疫霉 RxLR效應蛋白 互作 KH RNA結(jié)合蛋白(KHRBP)
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.32
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-33
• 1.1 馬鈴薯晚疫病的發(fā)生與危害及其病原特性12-19
• 1.1.1 晚疫病對馬鈴薯的危害12-13
• 1.1.2 馬鈴薯晚疫病的田間癥狀及流行規(guī)律13-14
• 1.1.3 致病疫霉菌P.infestans分類地位14
• 1.1.4 致病疫霉菌P.infestans形態(tài)學特性14-15
• 1.1.5 P.infestans侵染過程中的細胞生物學特性15-17
• 1.1.6 致病疫霉菌的侵染循環(huán)和生活史17-18
• 1.1.7 晚疫病菌的群體變異18-19
• 1.2 病原與寄主互作分子機理19-24
• 1.2.1 病原與寄主互作概念19-20
• 1.2.2 植物免疫與抗病性20-21
• 1.2.3 植物的抗病性21-24
• 1.3 效應蛋白種類及其研究進展24-30
• 1.3.1 質(zhì)外體效應蛋白（Apoplastic effectors）25-27
• 1.3.2 細胞質(zhì)效應蛋白（Cytoplasmic effectors）27-30
• 1.4 P.infestans RxLR效應蛋白與寄主互作及其功能30-31
• 1.4.1 PiAVR3a與CMPG1互作，抑制INFI誘導的細胞死亡30-31
• 1.4.2 PiAvr4與抗性基因R4互作，引起植物防衛(wèi)反應，表現(xiàn)無毒活性31
• 1.4.3 PiAvrblb1與LerRK1.9 互作，影響植物抗性31
• 1.4.4 PITG_03192與NTP1和NTP2互作，，抑制晚疫病菌的侵染31
• 1.5 致病疫霉效應蛋白RxLR在侵染階段具有不同的表達模式31-32
• 1.6 本研究的目的意義32-33
• 2 材料與方法33-47
• 2.1 材料33
• 2.1.1 供試菌株33
• 2.1.2 晚疫病菌培養(yǎng)基33
• 2.1.3 供試植株33
• 2.2 方法33-47
• 2.2.1 黑麥培養(yǎng)基制作方法33-34
• 2.2.2 晚疫病菌菌株保存及復壯34
• 2.2.3 P. infestans孢子懸浮液的制備34
• 2.2.4 P. infestans孢子懸浮液活體接種供試植物34
• 2.2.5 基因瞬時表達34-35
• 2.2.6 農(nóng)桿菌瞬時表達接種晚疫病菌分析實驗（ATTA）35-36
• 2.2.7 載體構(gòu)建、基因克隆及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化36-39
• 2.2.8 共聚焦成像及圖片處理39-40
• 2.2.9 葉片組織總RNA抽提40-41
• 2.2.10 DNase處理41
• 2.2.11 cDNA合成41
• 2.2.12蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作技術(shù)尋找Pi04089在寄主中的靶蛋白41-43
• 2.2.13基因表達分析43-44
• 2.2.14病毒誘導基因沉默（Virus Induced Gene Silencing，VIGS）44-45
• 2.2.15 Western blot檢測蛋白45-47
• 3 結(jié)果與分析47-69
• 3.1 Pi04089在植物體內(nèi)的功能鑒定與研究47-55
• 3.1.1 瞬時表達Pi04089基因，顯著促進晚疫病菌侵染47-48
• 3.1.2 Pi04089在植物體內(nèi)的亞細胞定位48-50
• 3.1.3 Pi04089在寄主細胞核仁中發(fā)揮作用，促進晚疫病菌侵染50-54
• 3.1.4 在晚疫病菌侵染早期階段，Pi04089表達量上調(diào)54-55
• 3.2 利用多項蛋白互作技術(shù)，尋找Pi04089的互作寄主靶蛋白55-60
• 3.2.1 酵母雙雜交技術(shù)（Yeast-Two-Hybrid）55-56
• 3.2.2 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）技術(shù)56-58
• 3.2.3 雙分子熒光互補實驗證明St KRBP1與Pi04089的互作關(guān)系58-60
• 3.3 Pi04089寄主互作靶蛋白StKRBP1的功能研究60-64
• 3.3.1 StKRBP1在植物體內(nèi)的亞細胞定位60
• 3.3.2 StKRBP1與Pi04089發(fā)生互作的亞細胞區(qū)域60-61
• 3.3.3 超量表達（overexpression）StKRBP1促進晚疫病菌生長61-62
• 3.3.4 在侵染早期階段，StKRBP1因Pi04089在植物體內(nèi)穩(wěn)定存在62-64
• 3.4 StKRBP1突變體構(gòu)建及其功能研究64-69
• 3.4.1 StKRBP1突變體構(gòu)建64
• 3.4.2 StKRBP1突變體與Pi04089互作消失64-65
• 3.4.3 StKRBP1突變體的亞細胞定位65-66
• 3.4.4 StKRBP1突變體與Pi04089在本氏煙中共表達66
• 3.4.5 StKRBP1突變體不再促進晚疫病菌的侵染66-69
• 4 討論69-74
• 4.1 效應蛋白Pi04089的研究價值69
• 4.2 效應蛋白Pi04089在植物體內(nèi)的亞細胞定位69
• 4.3 核定位信號的應用效果69
• 4.4 三項蛋白互作技術(shù)尋找Pi04089的寄主互作靶蛋白69-70
• 4.5 靶蛋白StKRBP1的功能研究及進展70-72
• 4.6 基因敲除靶蛋白StKRBP172
• 4.7 效應蛋白Pi04089和StKRBP1互作功能研究72-74
• 5 結(jié)論74-75
• 論文創(chuàng)新點75-76
• 致謝76-77
• 參考文獻77-89
• 附錄89-95
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文95

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