本文關(guān)鍵詞：棉花體細(xì)胞胚發(fā)生蛋白組學(xué)分析和GhTZF1基因功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：活性氧既能作為代謝副產(chǎn)物對(duì)植物造成氧化傷害,又能作為信號(hào)分子調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等過程�；钚匝醯碾p重作用取決于胞內(nèi)活性氧的水平。植物體具有一套完善的活性氧產(chǎn)生和清除系統(tǒng)調(diào)控著胞內(nèi)的活性氧穩(wěn)態(tài)平衡。在正常的生長(zhǎng)發(fā)育過程中,植物體內(nèi)活性氧的水平處于穩(wěn)態(tài)平衡。但是,一些逆境因子能打破活性氧的穩(wěn)態(tài)平衡,對(duì)植物造成氧化脅迫。植物體內(nèi)活性氧的穩(wěn)態(tài)維持對(duì)植物正常的生理代謝過程具有重要的作用。1.活性氧穩(wěn)態(tài)通過生長(zhǎng)素信號(hào)路徑調(diào)控棉花體細(xì)胞胚發(fā)生體細(xì)胞胚發(fā)生是體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變,經(jīng)歷與合子胚發(fā)育相似的階段,最終再生成完整植株的過程。體胚發(fā)生不僅是研究合子胚胎發(fā)育的良好模型,也是植物遺傳轉(zhuǎn)化、植株再生的有效體系。為了闡明體胚發(fā)生過程中復(fù)雜的分子事件以及控制體胚發(fā)生的因子,我們通過蛋白組學(xué)結(jié)合MADI-TOF/TOF方法,來發(fā)掘調(diào)控棉花體胚發(fā)生的相關(guān)蛋白,并探索其可能存在的分子調(diào)控機(jī)制。通過雙向電泳和質(zhì)譜鑒定,我們比較了棉花體胚發(fā)生過程中具有代表性的時(shí)間點(diǎn)/階段(0 h,2 d,NEC,EC,GE,TE,CE)的蛋白質(zhì)組。與起始時(shí)期0 h相比,我們鑒定了149個(gè)差異表達(dá)的蛋白。GO分析表明,這些差異表達(dá)的蛋白主要參與胞內(nèi)代謝、刺激響應(yīng)以及生長(zhǎng)發(fā)育和生殖等過程。一些逆境相關(guān)蛋白在棉花體胚發(fā)生過程中被激活且差異表達(dá),主要包括一些活性氧清除相關(guān)的酶,如APX、GST、SOD和硫氧還蛋白等。q RT-PCR分析表明,大部分編碼活性氧清除相關(guān)蛋白的基因,其在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平具有一致的表達(dá)模式。我們對(duì)部分編碼活性氧清除相關(guān)蛋白的基因進(jìn)行干涉表達(dá),以驗(yàn)證這些蛋白在棉花體胚發(fā)生中的作用。將Gh APXs在棉花中干涉表達(dá)后,Gh APXs干涉系中的過氧化氫含量顯著高于野生型,Gh APXs干涉系的體胚發(fā)生起始和脫分化過程被顯著抑制,而胚性細(xì)胞再分化過程被促進(jìn)。同樣,在棉花中干涉Gh GSTL3表達(dá)后,Gh GSTL3干涉系中的過氧化氫含量高于野生型,Gh GSTL3干涉系的體胚發(fā)生起始和脫分化過程與野生型相比無明顯差異,但是Gh GSTL3干涉系的再分化過程顯著提前。上述結(jié)果表明,這些基因可能通過調(diào)控活性氧穩(wěn)態(tài),進(jìn)而參與棉花體胚發(fā)生的調(diào)控。我們進(jìn)一步通過外源添加高濃度DPI、H2O2、BSO和GSH等化學(xué)物質(zhì),以改變內(nèi)源氧化還原穩(wěn)態(tài),來觀察氧化還原穩(wěn)態(tài)對(duì)體胚發(fā)生的影響。結(jié)果表明,氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞抑制了體細(xì)胞脫分化過程,而氧化環(huán)境則促進(jìn)了胚性愈傷向體胚的轉(zhuǎn)變,進(jìn)一步證實(shí)了活性氧穩(wěn)態(tài)參與了棉花體胚發(fā)生的調(diào)控。DPI和過氧化氫處理均導(dǎo)致了自由態(tài)生長(zhǎng)素含量降低、生長(zhǎng)素代謝改變以及生長(zhǎng)素運(yùn)輸和響應(yīng)相關(guān)基因的激活。抑制Gh APXs表達(dá),同樣導(dǎo)致了體胚發(fā)生過程中生長(zhǎng)素代謝改變,并且,生長(zhǎng)素運(yùn)輸和響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)與野生型相比也發(fā)生改變。這個(gè)結(jié)果顯示,無論是通過化學(xué)試劑還是通過抑制活性氧清除相關(guān)蛋白的表達(dá)來改變體內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài),均會(huì)改變體胚發(fā)生過程中的生長(zhǎng)素穩(wěn)態(tài)平衡。我們的研究表明,體胚發(fā)生激活了逆境相關(guān)基因的表達(dá),并通過活性氧穩(wěn)態(tài)和生長(zhǎng)素信號(hào)路徑動(dòng)態(tài)互作來調(diào)控棉花體胚發(fā)生。2.Gh TZF1通過抑制活性氧的積累來增強(qiáng)植株的耐旱性和延緩葉片衰老氧化還原穩(wěn)態(tài)對(duì)植物維持胞內(nèi)代謝至關(guān)重要。胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的打破會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞遭受氧化傷害進(jìn)而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。在細(xì)胞壁再生SSH文庫(kù)中,我們分離得到一個(gè)CCCH型串聯(lián)鋅指蛋白基因。通過RACE的方法,我們獲得該基因的全長(zhǎng),并通過結(jié)構(gòu)分析和聚類分析發(fā)現(xiàn),該基因具有植物特有的保守鋅指結(jié)構(gòu)域TZF,因而將該基因命名為Gh TZF1。表達(dá)模式分析表明,Gh TZF1在細(xì)胞壁再生的早期階段優(yōu)勢(shì)表達(dá)。組織表達(dá)模式分析表明,Gh TZF1在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá),且受葉片衰老誘導(dǎo)表達(dá)。此外,Gh TZF1受多種非生物逆境誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),如PEG和Na Cl等,Gh TZF1同樣受茉莉酸甲酯和過氧化氫的誘導(dǎo)表達(dá)。在擬南芥中超表達(dá)Gh TZF1,增強(qiáng)了植株的耐旱性并延緩了干旱誘導(dǎo)的葉片衰老。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,超表達(dá)Gh TZF1同樣能延緩黑暗和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的葉片衰老。在干旱和茉莉酸甲酯處理下,超表達(dá)系中過氧化氫的含量均顯著低于野生型。與此一致,在干旱處理?xiàng)l件下,活性氧清除相關(guān)的酶,如SOD和POD,其在超表達(dá)系中的酶活顯著高于野生型。q RT-PCR分析表明,干旱條件下,一些氧化相關(guān)的衰老相關(guān)基因在Gh TZF1超表達(dá)系中的表達(dá)量低于野生型。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,超表達(dá)Gh TZF1增強(qiáng)了植株對(duì)氧化脅迫的耐受性。在過氧化氫處理下,超表達(dá)系中活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)高于野生型,衰老相關(guān)基因的表達(dá)則低于野生型。因此,我們推測(cè),Gh TZF1可能通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡來調(diào)控植株對(duì)干旱的耐受性以及葉片衰老過程。
【關(guān)鍵詞】：棉花 體細(xì)胞胚發(fā)生 生長(zhǎng)素 氧化脅迫 耐旱性 葉片衰老延緩 過氧化氫 ROS GhTZF1
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S562
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 縮略詞表13-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-30
• 1 植物體細(xì)胞胚發(fā)生的研究進(jìn)展15-23
• 1.1 激素與體細(xì)胞胚發(fā)生16-18
• 1.1.1 生長(zhǎng)素與體胚發(fā)生16-17
• 1.1.2 細(xì)胞分裂素與體胚發(fā)生17
• 1.1.3 脫落酸與體胚發(fā)生17-18
• 1.1.4 其他激素與體胚發(fā)生18
• 1.2 逆境脅迫與體胚發(fā)生18-19
• 1.2.1 逆境因子對(duì)體胚發(fā)生的影響18
• 1.2.2 氧化還原與體胚發(fā)生18-19
• 1.3 體細(xì)胞胚發(fā)生的分子機(jī)理研究19-23
• 1.3.1 體胚發(fā)生相關(guān)基因的研究19-21
• 1.3.2 體胚發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)研究21-23
• 2 GhTZF1 在抗旱中的功能研究23-29
• 2.1 干旱對(duì)植物生長(zhǎng)的影響23
• 2.2 植物對(duì)干旱脅迫響應(yīng)類型23-24
• 2.3 植物抵御干旱脅迫的生理機(jī)制24-25
• 2.3.1 活性氧清除系統(tǒng)的啟動(dòng)24
• 2.3.2 維持水分代謝24
• 2.3.3 滲透調(diào)節(jié)24
• 2.3.4 增強(qiáng)根系活力24-25
• 2.3.5 增加光合速率25
• 2.4 植物響應(yīng)干旱的分子機(jī)制25-26
• 2.4.1 依賴于ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑25-26
• 2.4.2 非依賴于ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑26
• 2.5 干旱與葉片衰老26-27
• 2.5.1 影響葉片衰老的因素26
• 2.5.2 干旱與葉片衰老的關(guān)系26-27
• 2.6 CCCH型鋅指蛋白研究進(jìn)展27-29
• 2.6.1 鋅指蛋白的分類和結(jié)構(gòu)特征27-28
• 2.6.2 CCCH型鋅指蛋白的功能研究進(jìn)展28-29
• 3 本研究的目的和意義29-30
• 第二章 棉花體胚發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)分析30-63
• 1 材料和方法31-38
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料31
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法31-38
• 1.2.1 棉花體胚發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)分析31-34
• 1.2.2 GhAPXs和GhGSTL3 在體胚發(fā)生中的功能研究34
• 1.2.3 改變活性氧穩(wěn)態(tài)的相關(guān)處理34-35
• 1.2.4 活性氧的定性分析及過氧化氫的測(cè)定35-36
• 1.2.5 生長(zhǎng)素及生長(zhǎng)素代謝物的提取和測(cè)定36
• 1.2.6 RNA提取，RT-PCR和qRT-PCR分析36-38
• 2 結(jié)果與分析38-58
• 2.1 棉花體胚發(fā)生的蛋白表達(dá)譜分析38-43
• 2.1.1 棉花體胚發(fā)生不同時(shí)期的形態(tài)學(xué)38
• 2.1.2 棉花體胚發(fā)生過程的蛋白表達(dá)譜38-40
• 2.1.3 差異表達(dá)蛋白的鑒定及功能分類40-41
• 2.1.4 棉花體胚發(fā)生過程中與氧化還原相關(guān)的差異表達(dá)蛋白分析41-43
• 2.2 GhAPXs抑制表達(dá)加快非胚性愈傷向胚性愈傷轉(zhuǎn)化過程43-45
• 2.3 抑制GhGSTL3 的表達(dá)促進(jìn)了棉花體胚發(fā)生的再分化過程45-47
• 2.4 活性氧（ROS）穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)控體胚發(fā)生過程47-53
• 2.4.1 擾亂活性氧穩(wěn)態(tài)平衡抑制脫分化過程47-53
• 2.4.2 氧化環(huán)境促進(jìn)體胚發(fā)生再分化過程53
• 2.5 體胚發(fā)生過程中活性氧穩(wěn)態(tài)負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)素平衡53-56
• 2.5.1 DPI和H2O2處理打破了體胚發(fā)生過程中生長(zhǎng)素的動(dòng)態(tài)平衡53
• 2.5.2 干涉GhAPXs的表達(dá)改變了體胚發(fā)生過程中生長(zhǎng)素代謝53-55
• 2.5.3 活性氧對(duì)生長(zhǎng)素運(yùn)輸及信號(hào)路徑的影響55-56
• 2.5.4 外源施加生長(zhǎng)素能部分恢復(fù)DPI和H2O2導(dǎo)致的體胚發(fā)生受阻56
• 2.6 生長(zhǎng)素與ROS共同調(diào)控棉花體胚發(fā)生56-58
• 3 討論58-63
• 第三章 GhTZF1 基因的克隆及其在抗旱中的功能鑒定63-89
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法63-71
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料63
• 1.2 菌株和載體63
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法63-71
• 1.3.1 材料處理及cDNA模板制備63-64
• 1.3.2 基因克隆、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化64-67
• 1.3.3 基因生物信息學(xué)分析67
• 1.3.4 RT-PCR和qRT-PCR67
• 1.3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥PEG處理67
• 1.3.6 轉(zhuǎn)基因材料的干旱處理67-68
• 1.3.7 離體葉片衰老誘導(dǎo)68
• 1.3.8 H2O2處理68
• 1.3.9 過氧化氫、葉綠素和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定68-69
• 1.3.10 酶活測(cè)定69-71
• 1.3.11 統(tǒng)計(jì)分析71
• 2 結(jié)果與分析71-85
• 2.1 GhTZF1 基因的克隆和序列分析71-74
• 2.2 GhTZF1 基因的表達(dá)模式分析74-76
• 2.2.1 GhTZF1 的組織表達(dá)模式分析74
• 2.2.2 GhTZF1 在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析74-76
• 2.3 超表達(dá) GhTZF1 增強(qiáng)了植株的耐旱性76-80
• 2.3.1 GhTZF1 及其擬南芥同源基因的表達(dá)量檢測(cè)76
• 2.3.2 超表達(dá)GhTZF1 增強(qiáng)了對(duì)PEG的耐受性76-78
• 2.3.3 超表達(dá)GhTZF1 增強(qiáng)了植株耐旱性且延緩了干旱誘導(dǎo)的葉片衰老78-79
• 2.3.4 超表達(dá)GhTZF1 提高了SOD和POD酶活79-80
• 2.4 活性氧穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因和逆境誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因的表達(dá)80-82
• 2.5 超表達(dá)GhTZF1 延緩了黑暗、MeJA誘導(dǎo)的葉片衰老82-84
• 2.5.1 超表達(dá)GhTZF1 延緩了黑暗誘導(dǎo)的葉片衰老82-83
• 2.5.2 超表達(dá)GhTZF1 延緩了MeJA誘導(dǎo)的葉片衰老83-84
• 2.6 GhTZF1 增強(qiáng)了對(duì)過氧化氫的耐受性84-85
• 3 討論85-89
• 3.1 GhTZF1 是聯(lián)系抗旱性和葉片衰老延緩之間的紐帶85-87
• 3.2 GhTZF1 通過抑制活性氧的生成和積累來增強(qiáng)植株抗旱性和延緩葉片衰老 7387-89
• 參考文獻(xiàn)89-107
• 附錄107-142
• 攻讀學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表論文142-143
• 國(guó)家專利143-144
• 致謝144-146

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  本文關(guān)鍵詞：棉花體細(xì)胞胚發(fā)生蛋白組學(xué)分析和GhTZF1基因功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：302858