本文關(guān)鍵詞：PrP單抗的研制及其在BSE的免疫組化檢測和癢病的株系特征研究中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：BSE俗稱瘋牛病,1986年在英國首次發(fā)現(xiàn),病原體是一種缺少核酸的蛋白顆粒,稱為朊毒體(Prion),是神經(jīng)等細(xì)胞表面一種正常蛋白PrPC的異構(gòu)體PrPSc,近年來越來越多的證據(jù)支持BSE是人類nvCJD的病因,引起了全世界公眾對瘋牛病的恐慌。一個(gè)國家或地區(qū)的BSE風(fēng)險(xiǎn)狀況、發(fā)病情況和監(jiān)測系統(tǒng)的全面程度,已成為牛和牛產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易中一項(xiàng)重要指標(biāo),其中監(jiān)測系統(tǒng)的有效性,關(guān)鍵取決于檢測手段的可靠性,而免疫組化診斷方法是BSE診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中,首先克隆、表達(dá)、純化了羊、牛、人的PRNP基因,以純化的重組PrP蛋白免疫PrPo/0小鼠,成功研制出系列PrP單抗,并對單抗的免疫學(xué)反應(yīng)特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究。隨后,以自主研制的PrP單抗為核心試劑,成功建立了BSE免疫組化診斷方法,頒布為國家標(biāo)準(zhǔn)《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》(GB/T19180-2003),開發(fā)的試劑盒獲得了國家新獸藥證書。該方法已用于我國BSE的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測工作,至2006年底,共檢測了全國各地14014份牛腦樣品,結(jié)果全部為陰性,與國際標(biāo)準(zhǔn)單抗6H4的檢測符合率為100%,為我國的“無瘋牛病國際認(rèn)證工作”積累了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。最后,以PrP單抗為分子探針,在國際上最為詳盡地揭示了癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的株系特征,包括PrPSc的糖基化模式、腦部的病理學(xué)特征、PrPSc的沉積特點(diǎn)等。1羊、牛及人PrP基因的克隆及表達(dá)根據(jù)Gene Bank中PrP基因序列設(shè)計(jì)引物,以羊、牛及人血液中提取的基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增出PrP基因并進(jìn)行序列測定。同源性分析表明：推導(dǎo)的氨基酸序列,羊與牛的同源性為96.2%,羊與人的同源性為93.8%,牛與人的同源性為94.3%,羊、牛及人PrP的8肽重復(fù)區(qū)均為5個(gè)。將牛的PrP 25～233aa基因、羊PrP 77～226aa基因、羊PrP91～226aa基因、人PrP 91～230aa基因克隆至原核表達(dá)載體pET32a,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),His·Bind(?) Kits純化表達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE電泳顯示：表達(dá)產(chǎn)物的分子量大小與預(yù)計(jì)相符；免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)：牛PrP 25～233aa基因、羊PrP 77～226aa基因、羊PrP 94～226aa基因、人PrP 94～230aa基因獲得了正確表達(dá),具有良好的抗原性。2 PrP單抗的研制及其免疫學(xué)反應(yīng)特性的研究隨著BSE全球蔓延趨勢的加劇,我國迫切需要建立BSE免疫學(xué)檢測方法,具有相關(guān)免疫學(xué)反應(yīng)特性的PrP單抗是檢測的核心試劑。筆者以純化的重組PrP蛋白免疫Prpo/0小鼠,利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),間接ELISA試驗(yàn)篩選出9株可持續(xù)分泌特異性PrP抗體的雜交瘤細(xì)胞4C11、7C11、4H10、13A4、9D11、11G8、8C10、13B11、1H2。隨后,對上述PrP單抗的抗原表位及免疫學(xué)反應(yīng)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定。以原核表達(dá)的牛/羊/人PrP、正常牛/羊的腦勻漿、BSE/羊癢病陽性的腦勻漿、BSE/羊癢病陽性的腦組織切片、癢病小鼠適應(yīng)毒株RML及22L的腦勻漿為抗原,測定了9株單抗的ELISA、免疫印跡、免疫組化反應(yīng)特性。結(jié)果顯示：單抗4C11、1H2、8C10、13A4、13811可用于BSE/羊癢病的ELISA、免疫印跡檢測；單抗4C11、8C10、13811可用于BSE/羊癢病的免疫組化檢測。單抗1H2、13A4在免疫印跡及免疫組化試驗(yàn)中可識(shí)別癢病小鼠適應(yīng)毒株RML及22L。單抗7C11在免疫印跡試驗(yàn)中只與羊癢病PrP27-30反應(yīng),結(jié)合其抗原表位77-93aa,證實(shí)了BSE與Scrapie的PrPSc PK消化位點(diǎn)存在差異；單抗4H10的抗原表位推測是羊癢病PrP27-30特異性的。3單抗介導(dǎo)BSE免疫組化檢測方法的建立及其應(yīng)用在免疫組化試驗(yàn)中,PrP單抗4C11可特異性識(shí)別BSE、羊癢病標(biāo)準(zhǔn)陽性腦組織樣品上PrPSc核心片段,并與國際標(biāo)準(zhǔn)PrP單抗6H4具有相同的染色模式。用作核心試劑,建立了單抗介導(dǎo)BSE免疫組化診斷方法并標(biāo)準(zhǔn)化,現(xiàn)已頒布成為中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》(GB/T19180-2003),研發(fā)的BSE免疫組化診斷試劑獲得國家新獸藥證書。該方法應(yīng)用于中國BSE的實(shí)驗(yàn)室持續(xù)監(jiān)測工作,至2006年底,共檢測了全國各地采集的14,014份牛腦樣品,結(jié)果全為陰性,每批次所設(shè)立的陽性對照樣品檢測結(jié)果均呈陽性,與6H4檢測結(jié)果的符合率為100%,為我國“無瘋牛病國際認(rèn)證工作”積累了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。4癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的株系特征研究癢病小鼠適應(yīng)毒株RML感染的N2a細(xì)胞(Sc-N2a),經(jīng)連續(xù)傳代后仍能穩(wěn)定增殖Prpres,建立了感染癢病的細(xì)胞模型。以Sc-N2a細(xì)胞裂解物為接種體,腦內(nèi)接種C57BL/6J小鼠,經(jīng)200±28天的潛伏期后,接種的C57BL/6J小鼠全部發(fā)病死亡,臨床癥狀均表現(xiàn)為特征性的“共濟(jì)失調(diào)”,而對照組,接種N2a細(xì)胞裂解物的C57BL/6J小鼠以及接種Sc-N2a細(xì)胞裂解物的PrP基因敲除小鼠均正常存活,獲得了癢病感染的小鼠模型。隨后,PrP單抗作為分子探針,對癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的株系特征進(jìn)行了詳盡的研究。Sc-N2a細(xì)胞增殖的PrPsc與發(fā)病小鼠腦組織中PrPsc的免疫印跡圖譜展示了相同的糖基化模式,三種糖基化形式的PrPsc具相同遷移率(分子量大小一致),而且均是以單糖基化形式為主。發(fā)病小鼠的病理學(xué)研究結(jié)果顯示：腦部的海綿狀空泡主要分布于腦干、大腦、小腦、丘腦；腦、脾臟、回腸末端檢測到PrPSc,腦部的PrPsc主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦,四迭體、小腦、嗅球有少量的分布。綜上：1、成功克隆了羊、牛、人的PrP基因。同源性分析表明：推導(dǎo)的氨基酸序列,羊與牛的同源性為96.2%,羊與人的同源性為93.8%,牛與人的同源性為94.3%,羊、牛及人PrP的8肽重復(fù)區(qū)均為5個(gè)。2、獲得了純化的重組牛PrP 25～233aa、羊PrP 77～226aa、羊PrP 94～226aa、人PrP 94～230aa,具有良好的抗原性。3、研制出9株P(guān)rP單抗,并明確了其抗原表位及免疫學(xué)反應(yīng)特性,為下一步BSE及羊癢病的免疫學(xué)診斷方法的研制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。拿到針對PrP 77～93aa抗原表位的單抗7C11,該表位處于BSE與羊癢病PrPsc的PK消化位點(diǎn)的差異部位；單抗4H10的抗原表位推測是羊癢病PrP27-30特異性的；國內(nèi)外尚未見有同類單抗的報(bào)道。4、建立了單抗介導(dǎo)BSE免疫組化診斷方法(BSE診斷的金標(biāo)準(zhǔn)),實(shí)現(xiàn)了我國BSE檢測技術(shù)的跨越性發(fā)展,現(xiàn)已頒布成為國家標(biāo)準(zhǔn)《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》(GB/T19180-2003),用于我國BSE的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測工作。研發(fā)的BSE免疫組化診斷試劑于2006年獲得《國家新獸藥證書》。5、成功建立了感染癢病的細(xì)胞模型及小鼠模型。以PrP單抗為特異性分子探針,在國際上最為詳盡地揭示了癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的株系特征,包括PrPsc的糖基化模式、腦部的病理學(xué)特征、PrPsc的沉積特點(diǎn)等。
【關(guān)鍵詞】：PrP BSE 單抗 免疫組化 免疫學(xué)反應(yīng)特性 癢病小鼠適應(yīng)毒株 株系特征
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-12
• 符號(hào)說明12-14
• 綜述一 TSEs的分子致病機(jī)理14-24
• 1 TSEs的研究進(jìn)展14-16
• 2 TSEs的病原學(xué)16-21
• 2.1 “Prion”學(xué)說16-17
• 2.2 PrP的結(jié)構(gòu)與功能17-18
• 2.3 PrP~C-→PrP~(Sc)的轉(zhuǎn)變18-20
• 2.4 PRNP基因的多樣性20-21
• 3 TSEs的感染、致病機(jī)理21-24
• 綜述二 TSEs的流行病學(xué)24-32
• 1 重要的動(dòng)物TSEs24-27
• 1.1 癢病24
• 1.2 牛海綿狀腦病24-26
• 1.3 非典型性牛海綿狀腦病26
• 1.4 鹿慢性消耗性疾病26-27
• 2 TSEs的株系27-28
• 3 風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)28-31
• 3.1 肉骨粉(MBM)29
• 3.2 肌肉組織29-30
• 3.3 動(dòng)物脂肪與明膠30
• 3.4 奶30
• 3.5 血液30
• 3.6 尿30-31
• 4 跨物種傳播31-32
• 4.1 牛向其它家畜的傳播31
• 4.2 鹿科動(dòng)物向家畜傳播31
• 4.3 家畜向人類傳播31-32
• 綜述三 TSEs的診斷和治療32-42
• 1 TSEs的診斷32-37
• 1.1 死后診斷32-33
• 1.2 活體診斷33-37
• 2 TSEs的治療37-42
• 2.1 化學(xué)復(fù)合物37
• 2.2 免疫治療37-42
• 第一章 羊、牛及人PrP基因的克隆和原核表達(dá)42-49
• 1 材料與方法42-45
• 1.1 質(zhì)粒和菌種42-43
• 1.2 酶和試劑43
• 1.3 PrP基因克隆及序列測定43-44
• 1.4 PrP基因的原核表達(dá)44
• 1.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化及抗原性鑒定44-45
• 2 結(jié)果45-48
• 2.1 羊、牛及人PrP成熟蛋白基因的同源性分析45-46
• 2.2 PrP的原核表達(dá)46-48
• 3 討論48-49
• 第二章 PrP單抗的研制及其免疫學(xué)反應(yīng)特性研究49-64
• 1 材料與方法50-53
• 1.1 PrP單抗的研制50-51
• 1.2 PrP單抗的免疫學(xué)反應(yīng)特性鑒定51-53
• 2 結(jié)果53-61
• 2.0 PrP單抗的篩選53
• 2.1 單抗的抗原表位53-56
• 2.2 單抗與重組蛋白的ELISA反應(yīng)特性56-57
• 2.3 單抗與重組PrP蛋白的免疫印跡反應(yīng)特性57-58
• 2.4 單抗與腦勻漿中PrP~C的免疫印跡反應(yīng)特性58-59
• 2.5 單抗與PrP~(Sc)的免疫學(xué)反應(yīng)特性59-61
• 3 討論61-64
• 第三章 單抗介導(dǎo)BSE免疫組化檢測方法的建立及其應(yīng)用64-76
• 1 材料與方法65-69
• 1.1 試劑65
• 1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品65
• 1.3 單抗介導(dǎo)BSE免疫組織化學(xué)檢測方法的操作規(guī)程65
• 1.4 中國BSE的持續(xù)監(jiān)測65-67
• 1.5 瘋牛病免疫組織化學(xué)診斷試劑盒的制備67-69
• 2 結(jié)果69-74
• 2.1 單抗4C11介導(dǎo)BSE免疫組化檢測方法69-74
• 2.2 中國BSE的持續(xù)監(jiān)測74
• 2.3 BSE免疫組化診斷試劑盒74
• 3 討論74-76
• 第四章 癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的株系特征研究76-91
• 1 材料與方法77-78
• 1.1 細(xì)胞培養(yǎng)77
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物77
• 1.3 接種體77
• 1.4 動(dòng)物接種77
• 1.5 組織樣品的采集77
• 1.6 病理學(xué)檢查77-78
• 1.7 抗體78
• 1.8 免疫印跡78
• 2 結(jié)果78-89
• 2.1 Sc-N2a細(xì)胞增殖PrP~(res)的鑒定78-80
• 2.2 小鼠發(fā)病情況80-81
• 2.3 小鼠腦組織PrP~(Sc)的WB鑒定81-82
• 2.4 小鼠腦組織的病理學(xué)變化82-85
• 2.5 小鼠組織的免疫組化染色結(jié)果85-89
• 3 討論89-91
• 全文總結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-109
• 致謝109-110
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文110-111

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6 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所 劉雨田 王志亮 魏榮;關(guān)注傳播瘋牛病的罪魁元兇：癢病[N];中國畜牧報(bào);2004年

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9 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 田增義研究員;警惕“隱性惡魔”：癢病[N];中國畜牧報(bào);2005年

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本文編號(hào)：287936