水貂阿留申病(Aleutian Disease,AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease virus,AMDV)引起的水貂慢性進(jìn)行性疾病。水貂感染AMDV后主要癥狀為:采食下降、被毛粗亂、母貂空懷、流產(chǎn)或死胎,公貂出現(xiàn)生殖能力下降,少數(shù)出現(xiàn)急性死亡。該病與水貂病毒性腸炎、水貂犬瘟熱并稱為影響水貂健康的三大疫病,AD給養(yǎng)貂業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,目前,在世界范圍內(nèi)的水貂養(yǎng)殖地區(qū)均可見AD的發(fā)生。多年來世界各地養(yǎng)殖水貂國家的科研機(jī)構(gòu)一直努力開展疫苗研發(fā)工作,但因各種原因,始終未見成效。由于一直沒有有效的預(yù)防手段,使得AD得以迅速蔓延,當(dāng)前控制該病的最有效方法為:定期檢疫、淘汰陽性水貂、逐步凈化種群、建立無疫病養(yǎng)殖場。研究表明,我國貂群的AD血清學(xué)陽性率高達(dá)80%,因而有針對性的分離、鑒定我國流行毒株,研究病毒基因組進(jìn)化規(guī)律以及病毒的致病特性,建立健全適合的檢測方法,將有利于我國開展AD的診斷、防治、凈化。本研究主要包括以下4個(gè)部分:(1)AMDV的分離鑒定及基因組進(jìn)化分析采集黑龍江某水貂場經(jīng)對流免疫電泳(counter immune electrophoresis,CIEP)檢測為AD陽性,且臨診癥狀明顯的水貂肝臟、脾臟。組織通過研磨處理后接種貓腎細(xì)胞(CRFK)以進(jìn)行AMDV的分離。利用病毒形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)手段確認(rèn)自發(fā)病動物體內(nèi)成功分離到一株AMDV,命名為AMDV-HLJ。提取病毒基因組,PCR方法擴(kuò)增相應(yīng)片段,經(jīng)過拼接,獲得了部分NS1基因序列以及全部的VP2基因序列。遺傳進(jìn)化分析表明,AMDV-HLJ可能與國內(nèi)分離株LN1/LN2株由相同的祖先病毒進(jìn)化而來。通過對VP2蛋白中和性抗原結(jié)構(gòu)域的研究發(fā)現(xiàn),AMDV-HLJ株在兩個(gè)中和性抗原優(yōu)勢區(qū)的5個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸突變,但這些突變并未影響病毒的抗原性及致病性。(2)病毒分離株致病性分析將分離的病毒AMDV-HLJ感染健康水貂,通過臨診癥狀、剖檢的眼觀病變、臟器的病理學(xué)損傷以及病毒基因組的原位雜交等試驗(yàn)手段研究AMDV-HLJ株對水貂的致病機(jī)制。結(jié)果表明,AMDV-HLJ可導(dǎo)致水貂的嚴(yán)重發(fā)病,甚至死亡。病毒感染水貂后,其呈現(xiàn)多器官損傷;在組織病理學(xué)層面,病毒感染水貂的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)相應(yīng)器官均可出現(xiàn)典型的病毒感染病變,該結(jié)果進(jìn)一步表明,AMDV的感染可能會誘發(fā)細(xì)菌的繼發(fā)感染;組織原位雜交實(shí)驗(yàn)表明,AMDV不僅僅存在于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中,在睪丸生精細(xì)胞、II型肺泡上皮細(xì)胞、小腦浦肯野細(xì)胞內(nèi)均可檢測到病毒核酸,上述結(jié)果均表明,AMDV可在感染機(jī)體的多種器官內(nèi)的不同細(xì)胞復(fù)制,其可能利用多種致病機(jī)制損傷被其感染的宿主。(3)水貂阿留申病CIEP檢測方法的建立CIEP作為一種簡便易行的AD血清學(xué)檢測方法,一直以來以其準(zhǔn)確、高效、成本低等優(yōu)勢作為AD抗體檢測通用手段。但我國AD的CIEP檢測一直以來嚴(yán)重依賴進(jìn)口抗原,國產(chǎn)抗原也是源于進(jìn)口毒株,其與本地流行毒株抗原性差距較大。本實(shí)驗(yàn)利用AMDV-HLJ分離株進(jìn)行CIEP抗原制備,優(yōu)化制備流程,在不影響特異性和敏感性的前提下提高產(chǎn)出量。研究表明,基于分離毒株制備的CIEP抗原具有良好的特異性和敏感性,可應(yīng)用于日常的實(shí)驗(yàn)室或者現(xiàn)地AMDV抗體檢測。(4)可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測AMDV方法的建立在日常生產(chǎn)中,分子水平的AMDV檢測與血清學(xué)檢測手段互為補(bǔ)充。本研究成功建立了簡單、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)的AMDV LAMP檢測方法。研究表明,利用設(shè)計(jì)的6條引物能夠有效擴(kuò)增AMDV基因組,LAMP反應(yīng)在65°C 45min條件下達(dá)到擴(kuò)增產(chǎn)物的最大量值;敏感性試驗(yàn)表明,LAMP方法比傳統(tǒng)的PCR方法敏感100倍,且檢測結(jié)果可直接用肉眼觀察、判定,而不需要其他特殊的儀器裝置。利用該方法對現(xiàn)地樣品的檢測表明其適用于日常AMDV的分子檢測。目前國內(nèi)對于AD及AMDV的研究相對較少,本研究以國內(nèi)流行毒株為研究切入點(diǎn),分別從病毒進(jìn)化、致病機(jī)制及診斷方法三個(gè)層面探討中國AMDV分離株的生物學(xué)特性,為我國的AD防控起到積極作用。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S858.92
【部分圖文】：

促使人們發(fā)現(xiàn) AD 是一種傳染性疾病。1962 年由幾位學(xué)的傳染病特性[2,54]。1977 年，Porter 等證實(shí)，AD 病毒是細(xì)小月，病毒分類委員會最新病毒分類報(bào)告中，AMDV 被細(xì)小病毒亞科（Parvovirinae）、貂阿留申病毒屬（Amdo與牛犬細(xì)小病毒屬（Bocavirus）是細(xì)小病毒亞科的新成virus）、依賴病毒屬（Dependovirus）、紅細(xì)胞病毒屬（E5 個(gè)病毒屬。的形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化特征小病毒一樣，AMDV 的組成包括一條單股線性 DNA 和對稱，無囊膜、糖類和脂類，直徑 23～35nm[57]，分子質(zhì) 1.42～1.44g/cm3，沉降系數(shù)為 110S。由于病毒結(jié)構(gòu)簡單。對 DNA 酶不敏感，對蛋白酶敏感。一般有機(jī)溶劑，無影響。病毒耐高溫，80°C 存活 1h，90°C 存活 10min，林 4 周滅活�？勺贤鉁缁�，對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及 0.5%碘敏感[

圖 2-1 CIEP 平板示意圖Fig. 2-1 The abridged general view of CIEP agarose plate分離培養(yǎng)胞復(fù)蘇后接于 25cm2細(xì)胞瓶，全培養(yǎng)液為 10%胎牛血清的 MEM， 24h 內(nèi)細(xì)胞長成單層約 60%左右，可接毒。

細(xì)胞球縮、融合、脫落，殘留的貼壁細(xì)胞呈纖長狀。ck infected cells were used as negative control, did not change. B: The CPE on CRFK afteinoculation 6 days, amount of necrotic cells, shrinkage, fusion, shedding.圖 3-1 接毒后 CRFK 細(xì)胞病變Fig. 3-1 The CPE on CRFK after virus inoculation
【參考文獻(xiàn)】

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1 劉風(fēng)波;閆芳;許蓓;馮曉東;吳倩;;雞傳染性法氏囊病繼發(fā)大腸桿菌病的診治[J];國外畜牧學(xué)(豬與禽);2010年02期

2 吳威;聶金珍;程世鵬;牛景華;苗麗;吳玉林;;水貂阿留申病對流免疫電泳細(xì)胞抗原制備新方法的研究[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);1990年06期

3 關(guān)中湘,王樹志,向敬芝,樸厚坤,孫振天,吳鳳閣,林則君,賽友聯(lián),金玉英,孔照花,李建國,遲金山,馬春仿,劉靈云,馬俊,金學(xué)鋒,劉桂仁,崔義成;水貂阿留申病對流免疫電泳用診斷抗原的制備和試用[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);1987年01期

本文編號：2877068