針對畜禽養(yǎng)殖過程中抗生素的長時間、高劑量使用所引發(fā)的諸如超級耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生、食品安全隱患及環(huán)境污染等系列問題,研究新型抗生素替代品非常重要�？咕囊蚱浒踩愿摺⒖咕V廣及不易產(chǎn)生耐藥性等特點引起了人們的高度關(guān)注。最近研究表明,抗菌肽的功能不僅局限于抗菌,其在動物體內(nèi)更為重要的是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及屏障保護(hù)功能,因此本研究以開發(fā)新型抗生素替代品為目的,從研究動物源抗菌肽對緩解腸道炎癥和改善腸道物理屏障功能的角度出發(fā),在本課題組前期研究工作的基礎(chǔ)上篩選出兩種抗菌活性強、細(xì)胞毒性低的動物源抗菌肽C-BF與pBD2,首先以DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎為模型,系統(tǒng)研究了抗菌肽C-BF與pBD2對腸道炎癥的緩解作用及對腸上皮物理屏障功能的改善效果,進(jìn)一步通過體外試驗研究了抗菌肽緩解腸道炎癥及改善腸道物理屏障的途徑,旨在揭示其發(fā)揮上述功能的分子機制。主要研究結(jié)果如下：試驗一、抗菌肽對DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥影響的研究本試驗通過建立葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型,通過表觀癥狀、機體炎癥水平及結(jié)腸炎癥水平三個方面研究了抗菌肽C-BF和pBD2對DSS誘導(dǎo)小鼠腸道炎癥的影響：(1)DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎模型的建立及抗菌肽對DSS誘導(dǎo)小鼠表觀癥狀的影響：本研究通過3%的DSS成功誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,通過觀察記錄發(fā)現(xiàn),在誘導(dǎo)階段通過注射抗菌肽C-BF和pBD2,小鼠精神狀況得到明顯好轉(zhuǎn),且肛門出血癥狀得到有效改善,從評價疾病活動指數(shù)的三個指標(biāo)(日增重變化、糞便成型度、糞便隱血情況)的統(tǒng)計結(jié)果來看,隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加,注射抗菌肽組小鼠的體重變化趨勢與對照組接近,同時從對糞便成型度觀察及糞便隱血陽性檢測結(jié)果表明,DSS誘導(dǎo)組小鼠糞便成型度評分顯著高于對照組(p0.05),隱血陽性個體數(shù)逐日增加,而注射抗菌肽組小鼠上述兩指標(biāo)均發(fā)生明顯好轉(zhuǎn)。上述結(jié)果表明在DSS誘導(dǎo)引發(fā)的潰瘍性結(jié)腸炎模型中,注射兩種抗菌肽對小鼠表觀癥狀的改善起著積極作用,為后續(xù)深入的在分子層面開展研究提供了依據(jù)；(2)抗菌肽對小鼠全身炎癥水平的影響：在全血中主要免疫細(xì)胞比例方面,通過流式細(xì)胞術(shù)測定全血中主要免疫細(xì)胞的比例,結(jié)果表明DSS顯著下調(diào)了全血中巨噬細(xì)胞和B、T淋巴細(xì)胞的比例,而注射抗菌肽C-BF和pBD2后,均能在不同程度上提高上述主要免疫細(xì)胞的比例,說明其在一定程度上對機體先天及后天免疫功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用；在血清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)方面：通過ELISA法測定小鼠血清中各細(xì)胞因子的濃度,結(jié)果表明DSS顯著提高了血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的濃度(p0.05),而注射抗菌肽C-BF與pBD2后,血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10的濃度均顯著降低(p0.05),結(jié)果提示上述兩種抗菌肽可通過下調(diào)炎性因子的分泌緩解機體炎癥；(3)抗菌肽對小鼠結(jié)腸炎癥水平的影響：在結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤方面,通過免疫組化對小鼠結(jié)腸炎性細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,檢測各組結(jié)腸組織炎性細(xì)胞浸潤程度。結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)后炎性細(xì)胞浸潤程度顯著增加(p0.05),而注射抗菌肽C-BF和pBD2后,顯著改善了結(jié)腸組織炎性細(xì)胞浸潤狀況(p0.05),說明上述兩種抗菌肽可通過抑制入侵結(jié)腸組織炎性細(xì)胞的數(shù)量減緩腸道炎癥；在小鼠結(jié)腸nCRAMP表達(dá)豐度方面：通過免疫熒光技術(shù)對小鼠體內(nèi)抗菌肽mCRAMP進(jìn)行標(biāo)記,測定不同組別間mCRAMP的表達(dá)豐度。結(jié)果表明DSS處理顯著提高了結(jié)腸mCRAMP的表達(dá)豐度,而注射抗菌肽C-BF與pBD2后,mCRAMP的表達(dá)豐度與DSS組比顯著降低,結(jié)合前人的研究發(fā)現(xiàn)mCRAMP的表達(dá)水平與腸道炎癥狀態(tài)呈高度正相關(guān),此研究結(jié)果提示上述兩種抗菌肽對結(jié)腸炎癥水平具有明顯緩解作用；在結(jié)腸炎性相關(guān)酶活方面：通過對結(jié)腸組織INOS及COX-2的濃度進(jìn)行測定,結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)組INOS及COX-2的濃度顯著高于對照組(p0.05),而注射抗菌肽C-BF與pBD2后,結(jié)腸中INOS及COX-2的濃度顯著下調(diào)(p0.05),結(jié)果表明上述兩種抗菌肽可通過下調(diào)炎性相關(guān)酶濃度的方式緩解腸道炎癥。試驗二、抗菌肽緩解腸道炎癥的機制研究在試驗一發(fā)現(xiàn)抗菌肽C-BF與pBD2對改善DSS誘導(dǎo)小鼠表觀癥狀及緩解腸道炎癥有一定效果的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步從炎性相關(guān)信號通路炎癥水平、巨噬細(xì)胞吞噬功能及巨噬細(xì)胞極化功能三個方面對其緩解腸道炎癥的機制進(jìn)行探討：(1)抗菌肽緩解DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎的信號通路研究：在緩解腸道炎癥信號通路方面,通過western-blot對小鼠結(jié)腸組織炎性相關(guān)信號通路的磷酸化水平進(jìn)行分析,結(jié)果表明在DSS誘導(dǎo)下,會引起與炎性因子分泌相關(guān)的信號NF-κB(p65)及c-jun的磷酸化水平顯著提高(p0.05),而加入抗菌肽C-BF和pBD2處理后能顯著降低NF-κB(p65)的磷酸化水平(p0.05),但是對c-jun的磷酸化水平卻無明顯影響,上述結(jié)果提示抗菌肽C-BF和pBD2可能是通過抑制NF-κB(p65)而非c-jun的磷酸化水平緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥；在小鼠巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平方面：體外構(gòu)建RAW264.7細(xì)胞炎癥模型,通過ELISA法測定培養(yǎng)上清中TNF-α、PGE2及NO的濃度,結(jié)果表明抗菌肽C-BF和pBD2均可顯著降低LPS導(dǎo)致的RAW264.7細(xì)胞分泌上清中TNF-α、 PGE2及NO濃度的異常升高(p0.05),同時利用qRT-PCR測定促炎因子的基因表達(dá)水平,結(jié)果表明與LPS組比較,抗菌肽C-BF和pBD2預(yù)處理組顯著下調(diào)了RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、FN-γ、IL-8和MCP-1的基因表達(dá)水平(p0.05),上述結(jié)果說明抗菌肽C-BF和pBD2均可顯著降低RAW264.7細(xì)胞的炎癥水平；在緩解小鼠巨噬細(xì)胞炎癥信號通路方面：利用western-blot對炎性相關(guān)信號通路的磷酸化水平進(jìn)行分析,結(jié)果表明抗菌肽C-BF和pBD2預(yù)處理小鼠巨噬細(xì)胞,可顯著降低LPS引起的炎性信號因子AKT、IκB-α和NF-κB磷酸化水平的升高,上述結(jié)果再次證明了抗菌肽C-BF和pBD2可通過抑制NF-κB相關(guān)信號通路的磷酸化水平緩解炎癥。在上述研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽C-BF和pBD2具有緩解炎癥的功能及其可能的信號通路后,進(jìn)一步研究了其是否對正常巨噬細(xì)胞具有調(diào)控功能及其可能的分子機制：(2)抗菌肽對豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響及其機制：在對豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響方面,通過流式細(xì)胞術(shù)對不同濃度(12.5、25、50μg/ml)抗菌肽處理豬巨噬細(xì)胞后的吞噬功能進(jìn)行檢測,研究結(jié)果表明抗菌肽C-BF和pBD2對豬巨噬細(xì)胞的吞噬功能均具有促進(jìn)作用,其中抗菌肽C-BF具有劑量依賴效應(yīng)；在促進(jìn)豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的機制方面：通過RNAi技術(shù)干擾豬巨噬細(xì)胞表面TLR2/4,再用抗菌肽進(jìn)行處理后檢測其吞噬功能,研究結(jié)果表明TLR2和TLR4干擾后,抗菌肽C-BF和pBD2對豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用明顯減弱,說明上述兩種抗菌肽促進(jìn)豬巨噬細(xì)胞吞噬功能可能是通過TLR2/4信號途徑介導(dǎo),上述結(jié)果提示抗菌肽緩解腸道炎癥的另一機制可能是通過增強巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬功能,減少感染腸道病原菌數(shù)量實現(xiàn)；(3)抗菌肽協(xié)同誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞極化分型的作用：在豬巨噬細(xì)胞極化分型的影響方面,通過在誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞向不同分型極化的過程中,加入抗菌肽共同誘導(dǎo),分別利用western-blot和qRT-PCR檢測影響巨噬細(xì)胞極化分型關(guān)鍵信號因子的磷酸化水平和不同分型巨噬細(xì)胞表面特征分子的基因表達(dá)水平,研究結(jié)果表明抗菌肽C-BF和pBD2均可通過激活STAT-6的磷酸化水平協(xié)同誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞向M2型分化,同時也發(fā)現(xiàn)其協(xié)同誘導(dǎo)后上調(diào)了M2型巨噬細(xì)胞表面特征分子的基因表達(dá)水平,且抗菌肽C-BF的協(xié)同誘導(dǎo)效果優(yōu)于抗菌肽pBD2。該結(jié)果從影響巨噬細(xì)胞分型的角度揭示了抗菌肽C-BF和pBD2緩解炎癥的又一分子機制。試驗三、抗菌肽對DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道物理屏障的保護(hù)功能研究廣義的腸道屏障功能包括免疫屏障、物理屏障、化學(xué)屏障及微生物屏障,每個獨立的屏障功能相互影響,聯(lián)系十分密切。上述腸道炎癥的發(fā)生可定義為免疫屏障功能異常,因此我們在關(guān)注抗菌肽對腸道免疫屏障影響的同時,也開展了其對腸道物理屏障的作用研究。本研究從腸道形態(tài)、腸道電生理變化及結(jié)腸上皮凋亡與緊密連接蛋白表達(dá)三個方面研究了抗菌肽對小鼠腸道物理屏障的保護(hù)功能：(1)抗菌肽對DSS致小鼠腸道形態(tài)損傷的影響：在結(jié)腸形態(tài)方面,采集小鼠腸道樣品,制作HE染色切片對結(jié)腸形態(tài)進(jìn)行觀察,從腸道形態(tài)來看,與對照組相比,DSS誘導(dǎo)組小鼠結(jié)腸上皮受到嚴(yán)重的破壞,腸絨毛結(jié)構(gòu)雜亂無章,且用肉眼已完全無法分辨其腸上皮粘膜層結(jié)構(gòu),同時粘膜下層水腫嚴(yán)重,加入抗菌肽C-BF和pBD2處理組小鼠結(jié)腸絨毛結(jié)構(gòu)與DSS組相比發(fā)生明顯改變,腸絨毛間邊界清晰,具有完整的粘膜層形態(tài)結(jié)構(gòu),且粘膜下層水腫情況有了明顯改善；結(jié)果提示抗菌肽可明顯改善DSS導(dǎo)致的結(jié)腸上皮形態(tài)破壞；(2)抗菌肽對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸電生理學(xué)變化的影響：在上述發(fā)現(xiàn)抗菌肽對DSS致小鼠結(jié)腸形態(tài)破壞具有明顯改善的基礎(chǔ)上,開展了其對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸電生理學(xué)變化的影響。在結(jié)腸通透性高低方面：通過采樣前4h注射FITC-dextran,采樣后收集小鼠血清,用酶標(biāo)儀測定FITC-dextran濃度,結(jié)果表明,與正常對照組比較,DSS誘導(dǎo)組小鼠血清中FITC-dextran濃度顯著提高(p0.05),而注射C-BF后血清中FITC-dextran濃度與DSS組比較顯著下調(diào)(p0.05),注射pBD2后血清中FITC-dextran濃度有下降的趨勢,上述結(jié)果提示抗菌肽在不同程度上降低了DSS致結(jié)腸通透性增加；在結(jié)腸跨上皮電阻值方面：通過Ussing champer測定各組結(jié)腸粘膜跨上皮電阻值變化,結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)組小鼠跨上皮電阻值明顯低于40Ω,而不同抗菌肽處理組小鼠跨上皮膜電阻值均穩(wěn)定在40Ω以上,結(jié)果提示抗菌肽對于維持結(jié)腸電生理學(xué)的穩(wěn)定狀態(tài)具有積極作用；(3)抗菌肽對結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡及緊密連接蛋白表達(dá)的影響：在研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽可緩解DSS致結(jié)腸跨上皮電阻值下降的基礎(chǔ)上,對各組間結(jié)腸上皮的凋亡程度進(jìn)行分析。在結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡方面：通過TUNNEL試劑盒對結(jié)腸上皮凋亡情況進(jìn)行分析,結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)的小鼠其結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加(p0.05),而在DSS的誘導(dǎo)過程中,加入抗菌肽C-BF和pBD2處理的組別,其結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)與單獨用DSS誘導(dǎo)組相比顯著降低(p0.05),結(jié)果說明抑制結(jié)腸上皮凋亡水平可能是緩解跨上皮電阻值下降,維持腸道形態(tài)正常的原因之一；在緊密連接蛋白及黏蛋白表達(dá)方面：通過qRT-PCR檢測各組結(jié)腸組織緊密連接蛋白及黏蛋白的基因表達(dá)水平,結(jié)果表明：與對照組相比,DSS處理組顯著降低了緊密連接蛋白和黏蛋白的表達(dá)水平(p0.05),而加入抗菌肽處理的組別,不同程度的提高了緊密連接蛋白的表達(dá)水平,其中抗菌肽C-BF的促進(jìn)效果優(yōu)于pBD2。上述研究結(jié)果提示抗菌肽可通過改善緊密連接蛋白的表達(dá),維持腸道物理屏障功能正常。試驗四、抗菌肽保護(hù)腸道物理屏障的機制研究在上述研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽C-BF與pBD2對改善腸道物理屏障具有明顯效果的基礎(chǔ)上本研究從腸細(xì)胞單層跨上皮電阻值、細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)及腸細(xì)胞形態(tài)三個方面對其保護(hù)腸道物理屏障的機制進(jìn)行探討：(1)抗菌肽對DSS致腸上皮細(xì)胞單層跨膜電阻值降低的影響：在Caco-2細(xì)胞單層跨膜電阻值方面,本研究模擬體內(nèi)腸上皮組織結(jié)構(gòu)特點,體外培養(yǎng)入Caco-2細(xì)胞至單層分化狀態(tài),用DSS進(jìn)行細(xì)胞模型的建立,研究結(jié)果表明DSS單獨處理組Caco-2細(xì)胞單層跨上皮電阻值顯著低于對照組(p0.05),而抗菌肽C-BF和pBD2預(yù)處理的組別,其跨上皮電阻值與對照組接近；(2)抗菌肽對Caco-2細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)及緊密連接蛋白表達(dá)的影響：在Caco-2細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)方面,通過透射電鏡對培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞單層緊密連接結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,研究結(jié)果表明DSS可使本來結(jié)構(gòu)完整清晰的緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞,而用抗菌肽C-BF和pBD2預(yù)處理的組別,其緊密連接結(jié)構(gòu)完整,說明維持緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性是抗菌肽緩解DSS致跨上皮電阻值降低的機制之一；在緊密連接蛋白的表達(dá)方面：通過western-blot和qRT-PCR分析抗菌肽對DSS致緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)的影響,結(jié)果表明與正常對照組比較,DSS處理組ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達(dá)水平均顯著低于對照組(p0.05),而加入抗菌肽預(yù)處理后,上述三個緊密連接蛋白的表達(dá)水平均有不同程度升高,提示抗菌肽可促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)維持緊密連接結(jié)構(gòu)完整性；(3)抗菌肽對單個上皮細(xì)胞形態(tài)的影響：在單個Caco-2細(xì)胞形態(tài)方面,通過掃描電鏡觀察抗菌肽對DSS致單個Caco-2細(xì)胞形態(tài)破壞的影響,結(jié)果表明DSS處理組Caco-2細(xì)胞表面微絨毛形態(tài)受到嚴(yán)重破壞,呈光滑狀,從多細(xì)胞視野中甚至可以看到一些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生瓦解或呈現(xiàn)碎片樣,而在DSS刺激前加入抗菌肽C-BF和pBD2預(yù)處理的各組,其Caco-2細(xì)胞表面微絨毛形態(tài)與對照組接近,提示抗菌肽對單個上皮細(xì)胞的正常生長同樣具有保護(hù)作用。綜上所述,本研究通過DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型發(fā)現(xiàn)抗菌肽C-BF和pBD2具有顯著緩解腸道炎癥和改善腸道物理屏障的功能,并揭示了其緩解炎癥和改善屏障功能的內(nèi)在機制,研究結(jié)果提示上述兩種抗菌肽具有替代抗生素治療人類或動物腸炎的藥用前景。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S859.79
【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 抗菌肽的研究歷史
        1.1 抗菌肽的來源
        1.2 抗菌肽的分類
            1.2.1 Cathelicidins家族抗菌肽
            1.2.2 Defensins家族抗菌肽
                1.2.2.1 α-Defensins
                1.2.2.2 β-Defensins
                1.2.2.3 θ-Defensins
    2 抗菌肽的生物學(xué)功能及其作用機制
        2.1 抗菌肽的殺菌功能及其機制研究
            2.1.1 桶板模型
            2.1.2 地毯模型
            2.1.3 環(huán)形（圓環(huán)）-氣孔模型
            2.1.4 胞內(nèi)作用機制
            2.1.5 細(xì)菌抗性機制
        2.2 抗菌肽的免疫調(diào)控功能及其機制研究
            2.2.1 宿主防御肽的抗感染特性
            2.2.2 抗菌肽對免疫細(xì)胞的作用機制
                2.2.2.1 抗菌肽對免疫細(xì)胞的作用受體及相關(guān)信號通路
                2.2.2.2 抗菌肽對免疫細(xì)胞分化功能的影響
                2.2.2.3 抗菌肽選擇性改變炎癥反應(yīng)
                2.2.2.4 抗菌肽作為免疫佐劑發(fā)揮作用
        2.3 抗菌肽的屏障功能及其機制研究
            2.3.1 LL-37調(diào)節(jié)血管再生及細(xì)胞生長機制
    3 抗菌肽與炎癥疾病
        3.1 抗菌肽與腸道炎癥疾病的關(guān)系
            3.1.1 機體自身抗菌肽分泌與克羅恩病的關(guān)系
            3.1.2 機體自身抗菌肽分泌與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系
        3.2 抗菌肽保護(hù)腸道炎癥疾病的研究
            3.2.1 Denfesin家族抗菌肽與腸道炎癥疾病
            3.2.2 Cathelicidin家族抗菌肽與腸道炎癥疾病
            3.2.3 殺菌通透性增加蛋白（BPI）與腸道炎癥疾病
            3.2.4 人工合成抗菌肽與腸道炎癥疾病
        3.3 抗菌肽與膿毒血癥
            3.3.1 LPS與抗菌肽結(jié)合的分子基礎(chǔ)
            3.3.2 抗菌肽抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的機制
                3.3.2.1 識別并結(jié)合循環(huán)系統(tǒng)中的LPS分子
                3.3.2.2 從LBP上轉(zhuǎn)移LPS分子至膜CD14上
                3.3.2.3 通過CD14-LPS復(fù)合物激活TLR4和其他信號分子
                3.3.2.4 抗菌肽調(diào)控TLR4下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路緩解LPS炎癥
            3.3.3 內(nèi)源及合成抗菌肽在人與小鼠敗血癥中的作用
    4 本研究的目的意義與主要內(nèi)容
        4.1 目的意義
        4.2 主要內(nèi)容
第二章 抗菌肽對DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠免疫保護(hù)功能研究
    1.1 腹腔注射抗菌肽的吸收代謝規(guī)律研究
        1.1.1 實驗材料及儀器
            1.1.1.1 抗菌肽
            1.1.1.2 實驗動物
            1.1.1.3 其他實驗材料及儀器
        1.1.2 實驗方法
        1.1.3 實驗結(jié)果
        1.1.4 討論
    1.2 UC小鼠模型的建立及抗菌肽對表觀癥狀的影響
        1.2.1 實驗材料及儀器
            1.2.1.1 抗菌肽及葡聚糖硫酸鈉
            1.2.1.2 實驗動物
            1.2.1.3 其他實驗試劑及儀器
        1.2.2 實驗方法
        1.2.3 實驗結(jié)果
        1.2.4 討論
    1.3 抗菌肽對腸道免疫功能的調(diào)節(jié)作用
        1.3.1 抗菌肽對外周血中巨噬細(xì)胞,B,T淋巴細(xì)胞,NK細(xì)胞比率的影響
            1.3.1.1 實驗材料及儀器
            1.3.1.2 實驗方法
            1.3.1.3 實驗結(jié)果
                1.3.1.3.1 抗菌肽對外周血中巨噬細(xì)胞比例的影響
                1.3.1.3.2 抗菌肽對外周血中B淋巴細(xì)胞比例的影響
                1.3.1.3.3 抗菌肽對外周血中T淋巴細(xì)胞比例的影響
                1.3.1.3.4 抗菌肽對外周血中NK細(xì)胞比例的影響
        1.3.2 抗菌肽對DSS誘導(dǎo)小鼠回腸,結(jié)腸內(nèi)源抗菌肽（mCRAMP）表達(dá)的影響
            1.3.2.1 實驗材料及儀器
            1.3.2.2 實驗方法
            1.3.2.3 實驗結(jié)果
                1.3.2.3.1 抗菌肽對DSS誘導(dǎo)小鼠回腸mCRAMP表達(dá)的影響
                1.3.2.3.2 抗菌肽對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸mCRAMP表達(dá)的影響
        1.3.3 抗菌肽對血清及結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
            1.3.3.1 實驗材料及儀器
            1.3.3.2 實驗方法
            1.3.3.3 實驗結(jié)果
                1.3.3.3.1 抗菌肽對血清中細(xì)胞因子分泌水平的影響
                1.3.3.3.2 抗菌肽對結(jié)腸組織細(xì)胞因子基因表達(dá)水平的影響
        1.3.4 抗菌肽對結(jié)腸處炎性細(xì)胞浸潤的影響
            1.3.4.1 實驗材料及儀器
            1.3.4.2 實驗方法
            1.3.4.3 實驗結(jié)果
                1.3.4.3.1 抗菌肽對結(jié)腸嗜中性粒細(xì)胞入侵的影響
                1.3.4.3.2 抗菌肽對結(jié)腸巨噬細(xì)胞入侵的影響
                1.3.4.3.3 抗菌肽對結(jié)腸免疫細(xì)胞特異性分泌酶活水平的影響
        1.3.5 抗菌肽對結(jié)腸炎性相關(guān)酶濃度的影響
            1.3.5.1 實驗材料及儀器
            1.3.5.2 實驗方法
            1.3.5.3 實驗結(jié)果
                1.3.5.3.1 抗菌肽對結(jié)腸炎性相關(guān)酶（INOS和COX-2）濃度的影響
        1.3.6 抗菌肽對回盲端及血清中免疫球蛋白水平的影響
            1.3.6.1 實驗材料與儀器
            1.3.6.2 實驗方法
            1.3.6.3 實驗結(jié)果
                1.3.6.3.1 抗菌肽對回腸末端sIgA濃度的影響
                1.3.6.3.2 抗菌肽對血清IgA、IgG、IgM分泌水平的影響
        1.3.7 討論
第三章 抗菌肽在免疫調(diào)節(jié)方面的初步機制研究
    1.1 抗菌肽緩解炎癥的信號通路研究
        1.1.1 抗菌肽緩解結(jié)腸炎小鼠的信號通路研究
            1.1.1.1 實驗材料和儀器
            1.1.1.2 實驗方法
            1.1.1.3 實驗結(jié)果
        1.1.2 抗菌肽緩解小鼠RAW264.7細(xì)胞炎癥的信號通路研究
            1.1.2.1 實驗材料與儀器
            1.1.2.2 實驗方法
            1.1.2.3 實驗結(jié)果
                1.1.2.3.1 不同濃度抗菌肽對巨噬細(xì)胞毒性的影響
                1.1.2.3.2 不同濃度LPS對巨噬細(xì)胞毒性的影響
                1.1.2.3.3 抗菌肽對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
                1.1.2.3.4 抗菌肽緩解LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的信號通路研究
        1.1.3 討論
    1.2 抗菌肽對豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響及其機制研究
        1.2.1 抗菌肽對豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
            1.2.1.1 實驗材料及儀器
            1.2.1.2 實驗方法
            1.2.1.3 實驗結(jié)果
        1.2.2 抗菌肽對豬巨噬細(xì)胞干擾TLR2/4后吞噬功能的影響
            1.2.2.1 TLR2/4干擾的豬巨噬細(xì)胞系建立
                1.2.2.1.1 實驗材料與儀器
                1.2.2.1.2 實驗方法
                1.2.2.1.3 實驗結(jié)果
            1.2.2.2 抗菌肽對TLR2/4干擾后豬巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
                1.2.2.2.1 實驗材料與儀器
                1.2.2.2.2 實驗方法
                1.2.2.2.3 實驗結(jié)果
        1.2.3 討論
    1.3 抗菌肽對TLR4干擾后巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響
        1.3.1 實驗材料與儀器
        1.3.2 實驗方法
        1.3.3 實驗結(jié)果
        1.3.4 討論
    1.4 抗菌肽協(xié)同誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞的極化作用研究
        1.4.1 實驗材料
        1.4.2 實驗方法
        1.4.3 實驗結(jié)果
        1.4.4 討論
    1.5 抗菌肽對小鼠巨噬細(xì)胞表面共刺激分子的影響
        1.5.1 實驗材料及儀器
        1.5.2 實驗方法
        1.5.3 實驗結(jié)果
        1.5.4 討論
第四章 抗菌肽對腸道屏障的功能研究
    1.1 抗菌肽C-BF與pBD2對UC腸炎小鼠的屏障保護(hù)研究
        1.1.1 抗菌肽對腸道通透性的影響研究
            1.1.1.1 實驗材料及儀器
            1.1.1.2 實驗方法
            1.1.1.3 實驗結(jié)果
        1.1.2 抗菌肽C-BF與pBD2對回腸和結(jié)腸上皮形態(tài)的影響
            1.1.2.1 實驗材料及儀器
            1.1.2.2 實驗方法
            1.1.2.3 實驗結(jié)果
        1.1.3 抗菌肽C-BF與pBD2對結(jié)腸上皮凋亡水平的影響
            1.1.3.1 實驗材料及儀器
            1.1.3.2 實驗方法
            1.1.3.3 實驗結(jié)果
        1.1.4 抗菌肽C-BF與pBD2對結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響
            1.1.4.1 實驗材料及儀器
            1.1.4.2 實驗方法
            1.1.4.3 實驗結(jié)果
        1.1.5 討論
    1.2 抗菌肽C-BF對LPS致大鼠腸炎的屏障保護(hù)及治療效果研究
        1.2.1 抗菌肽C-BF對空腸上皮形態(tài)的作用效果
            1.2.1.1 實驗材料及儀器
            1.2.1.2 實驗方法
            1.2.1.3 實驗結(jié)果
        1.2.2 抗菌肽C-BF對大鼠空腸上皮超微結(jié)構(gòu)的影響
            1.2.2.1 實驗材料及儀器
            1.2.2.2 實驗方法
            1.2.2.3 實驗結(jié)果
        1.2.3 抗菌肽C-BF對大鼠腸道通透性的影響
            1.2.3.1 實驗材料及儀器
            1.2.3.2 實驗方法
            1.2.3.3 實驗結(jié)果
        1.2.4 抗菌肽C-BF對大鼠空腸緊密連接蛋白相關(guān)基因的影響
            1.2.4.1 實驗材料
            1.2.4.2 實驗方法
            1.2.4.3 實驗結(jié)果
        1.2.5 討論
第五章 抗菌肽對腸道屏障功能的初步機制研究
    1.1 抗菌肽C-BF與pBD2對DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞屏障功能的影響
        1.1.1 抗菌肽對Caco-2細(xì)胞單層通透性的影響研究
            1.1.1.1 實驗材料及儀器
            1.1.1.2 實驗方法
            1.1.1.3 實驗結(jié)果
        1.1.2 抗菌肽C-BF與pBD2對Caco-2細(xì)胞單層的緊密連接蛋白的影響研究
            1.1.2.1 實驗材料及儀器
            1.1.2.2 實驗方法
            1.1.2.3 實驗結(jié)果
        1.1.3 抗菌肽C-BF與pBD2對Caco-2細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)及腸細(xì)胞微絨毛的影響研究
            1.1.3.1 實驗材料及儀器
            1.1.3.2 實驗方法
            1.1.3.3 實驗結(jié)果
        1.1.4 討論
    1.2 抗菌肽C-BF與pBD2保護(hù)細(xì)菌入侵腸上皮細(xì)胞的影響
        1.2.1 抗菌肽對大腸桿菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
            1.2.1.1 實驗材料與儀器
            1.2.1.2 實驗方法
            1.2.1.3 實驗結(jié)果
        1.2.2 抗菌肽對大腸桿菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
            1.2.1.1 實驗材料及儀器
            1.2.1.2 實驗方法
            1.2.1.3 實驗結(jié)果
        1.2.3 抗菌肽對大腸桿菌侵染單個細(xì)胞的形態(tài)保護(hù)研究
            1.2.3.1 實驗材料及儀器
            1.2.3.2 實驗方法
            1.2.3.3 實驗結(jié)果
        1.2.4 討論
    1.3 抗菌肽C-BF對IPEC-J2細(xì)胞的炎癥水平的影響及機制
        1.3.1 實驗材料
        1.3.2 實驗方法
        1.3.3 實驗結(jié)果
        1.3.4 討論
第六章 結(jié)論、創(chuàng)新點與研究展望
    1 結(jié)論
    2 創(chuàng)新點
    3 研究展望
參考文獻(xiàn)
作者簡歷及取得的科研成果

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王艷榮;楊峰;劉靜;周婭;;槐定堿與TLR4/MD-2阻斷劑對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞TLR4-NF-κB-TNF-α通路的影響[J];中國中藥雜志;2012年20期

本文編號：2873681