黃瓜(Cucumis sativus)是深受人們喜愛的一種世界性蔬菜,具有很高的經濟價值。我國是目前世界上黃瓜種植規(guī)模和產量最大的國家。因此,改善黃瓜品質,提高其抗性,實現黃瓜的優(yōu)質、高效生產至關重要。本實驗室前期以兩個黃瓜自交系RNS8(白刺品種)和RNS9(黑刺品種)為材料,通過轉錄組和代謝組聯合分析,揭示了黃瓜黑刺中含有黃酮醇化合物,并將定位區(qū)間內的一個R2R3-MYB轉錄因子CsMYB60定為B(Black spine)候選基因。然而黑刺分離所得的黃酮醇化合物的顏色并不是黑色的,說明黑刺中除黃酮醇之外還含有其他代謝物。因此,黃瓜黑刺中代謝物的種類和其生物合成的調控機制,CsMYB60是否為B基因以及該基因的功能都需進一步研究。本文通過相關生理生化試驗,鑒定出黃瓜黑刺中含有原花青素物質,并解析了CsMYB60基因調控黃瓜原花青素合成的分子機制以及該基因在抗病性方面的生物學功能。具體研究結果如下:1.通過DMACA化學組織染色法和高效液相色譜質譜聯用法鑒定黃瓜黑刺中含有原花青素物質。2.測序結果表明,22個不同黑白刺黃瓜自交系中CsMYB60基因序列存在多態(tài)性。與RNS9中CsMYB60基因的序列相比,其中5個白刺自交系的等位基因中均含有一個SNP,另外9個白刺自交系的等位基因中有一個大片段的插入。同時,實時熒光定量PCR分析表明黃瓜黑刺自交系中CsMYB60基因的表達量均顯著高于白刺自交系。3.實時熒光定量PCR分析表明,在黃瓜果刺的不同發(fā)育時期,RNS9中CsMYB60與原花青素合成途徑相關基因的表達量均顯著高于RNS8。同時,運用基因槍轉化系統(tǒng)和高效液質聯用系統(tǒng)證明了分別過表達CsMYB60和Cs4CL可以誘導白刺中積累原花青素。表明CsMYB60通過調控Cs4CL促進黃瓜黑刺中原花青素的合成。4.測序結果分析表明,RNS8中CsMYB60基因的內含子區(qū)域插入了一個轉座元件—CsMULE(Mutator-like element)。同時,McrBC酶切法和重亞硫酸鹽測序法證明,RNS8中CsMYB60啟動子區(qū)域甲基化程度高于RNS9。表明在RNS8中,CsMYB60內含子區(qū)域轉座子的插入可能影響了其啟動子的甲基化水平。5.與WT相比,CsMYB60過表達株系的葉片中總葉綠素和類胡蘿卜素的含量顯著降低,果實中VC和可溶性糖的含量顯著增加且多種揮發(fā)性香氣物質的含量都顯著升高,其中最具黃瓜果實特征性風味的反,順-2,6-壬二烯醛的含量變化最為顯著。表明,過表達CsMYB60提高了黃瓜的果實品質。6.接種灰霉病菌后,CsMYB60過表達株系的病斑面積約為WT的兩倍,且茉莉酸和H_2O_2的含量顯著低于WT。表明過表達CsMYB60通過減少茉莉酸和H_2O_2的含量降低了黃瓜對灰霉病的抗性。7.通過黃瓜子葉瞬時表達系統(tǒng),篩選出CsWRKY50、CsWRKY10、CsWRKY47三個可能參與到CsMYB60調控黃瓜響應灰霉病菌過程的基因。進一步通過人工接種病原菌發(fā)現,CsWRKY10基因表達量受灰霉病菌誘導最為強烈,且在CsWRKY10啟動子中發(fā)現了兩個MYB蛋白結合的順式作用元件。同時,酵母單雜交實驗證明,CsMYB60可以直接結合CsWRKY10的啟動子。表明CsWRKY10很可能作為CsMYB60的下游基因調控黃瓜對灰霉病的抗性。8.通過農桿菌介導的黃瓜遺傳轉化體系得到CsWRKY10過表達植株,人工接種灰霉病菌后發(fā)現,與WT相比,轉基因株系的病斑面積顯著增加,H_2O_2和O_2~-的含量顯著降低。利用光學顯微鏡對灰霉病菌侵染WT和轉基因植株的過程進行觀察,發(fā)現接種8 h后,轉基因株系上有個別孢子開始萌發(fā),而WT上的孢子均沒有萌發(fā);接種10 h后,WT的孢子部分萌發(fā),而轉基因植株上的孢子幾乎全部萌發(fā)且芽管顯著伸長;隨著侵染時間的增加,相同時間下CsWRKY10過表達株系上菌絲的蔓延程度明顯高于WT。表明過表達CsWRKY10減少植株中ROS積累,促進灰霉病菌孢子萌發(fā)及菌絲伸長,增加對灰霉病的敏感性。9.接種灰霉病菌后,與WT相比,CsWRKY10過表達株系中茉莉酸的含量顯著降低;茉莉酸介導的抗病途徑的關鍵基因CsMYC2表達量顯著上升,CsPDF1.2表達量顯著下降,而水楊酸信號途徑的關鍵基因CsICS及CsPR1的表達量均顯著升高。表明在受到灰霉病菌侵染后,CsWRKY10參與激活了水楊酸信號通路,但是抑制了茉莉酸介導的抗病信號途徑。10.CsWRKY10可以被活體營養(yǎng)型病原菌—靶斑病菌所誘導;并且接種病原菌后,CsWRKY10過表達株系的病斑面積顯著小于WT。表明過表達CsWRKY10提高了黃瓜對靶斑病的抗性。本研究揭示了CsMYB60基因的多重功能。過表達CsMYB60正調控黃瓜果刺中原花青素的合成,并通過增加果實中VC、可溶性糖和揮發(fā)性物質的含量來提高黃瓜果實品質;并且CsMYB60直接調控CsWRKY10基因的表達,減少ROS的含量,同時抑制茉莉酸的合成及其介導的抗病信號途徑,從而降低黃瓜對灰霉病的抗性。以上結果說明了生物中基因的多效性,同時也為今后通過分子設計育種改良黃瓜的品質和抗病性提供了一定的理論基礎。
【學位單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S436.412.13
【部分圖文】：

原花青素特異途徑包括無色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)和花青素還原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)兩條途徑。無色花青素還原酶可以直接將無色花青素催化成2,3-反式黃烷-3-醇(2,3-trans-flavan-3-ol,catechin,兒茶素),主要包括兒茶素C和沒食子兒茶素GC(194)�；ㄇ嗨剡�原酶可以催化花青素生成2,3-順式黃烷-3-醇(2,3-cis-flavan-3-ol,epicatechm,表兒茶素),主要包括兒茶素EC和表沒食子兒茶素EGC(Yuan et al.,2012)。兒茶素和表兒茶素是原花青素的單體,最終聚合形成原花青素。1.2.1.2原花青素合成的分子調控機制

植物中MYB轉錄因子在N端均含有一段約51~52個氨基組成的MYB結構域。MYB結構域折疊成螺旋-轉角-螺旋(HTH)的形式與DNA大溝結合(Riechmann et al.,2000;Lipsick,1996),而MYB蛋白中均含有1~3個串聯且不完全重復的MYB結構域(R1、R2和R3)。根據MYB蛋白中該結構域的個數,將其分為4類:單一的MYB結構域(R1/R2)亞類;含有兩個MYB結構域的R2R3MYB亞類;含有三個MYB結構域的R1R2R3MYB亞類;含有四個MYB結構域的4RMYB亞類(劉守梅等,2012;Dubos et al.,2010;圖2)。其中,最小的亞家族是4R-MYB,成員均含有4個R1/R2重復序列(圖2),例如擬南芥的At3g18100基因。R2R3MYB亞類成員數目是最多的,參與到了控制細胞分化、次生代謝調節(jié)、應答激素刺激和抵御病原菌侵染等過程中(陳俊和王宗陽,2002)。1.2.2.2 MYB轉錄因子功能研究進展

茉莉酸不僅可以直接抑制病原菌的生長,在植物抵御灰霉病菌的過程中,茉莉酸更主要的是作為一種信號物質,激活抗病途徑,誘導產生病程相關蛋白以及其他抗菌物質。JA信號模塊主要由以下三部分組成:F-box蛋白、CORONATIN INSENSITIVE1(COI1)、Cullin1和Skp1-like1形成的具有功能性的Skp-Cullin-F-box(SCF)E3泛素連接酶復合物(Du et al.,2017);轉錄抑制因子JAZ(jasmonate-ZIM domain)蛋白(Yan et al.,2007);JA通路的關鍵調控因子MYC2(Zhai et al.,2013)。正常情況下,JAZ蛋白與MYC2結合并抑制其轉錄活性。當植物受到病原體侵染時,JA水平升高導致SCFCOI1復合物識別JAZ蛋白并使其泛素化,進而被26S蛋白酶體選擇性降解,解除了JAZ蛋白對轉錄激活因子MYC2轉錄活性的抑制,從而激活JA應答基因的表達,增強抗病性。前人研究結果表明,番茄中茉莉酸不敏感突變體(jai1)的灰霉病斑大小是野生型的3倍。SlMYC2通過調控病原菌應答基因正向調控植株對灰霉病的抗性,相反SlMYC2-RNAi植株對灰霉病的敏感性顯著高于WT(Du et al.,2017;圖3)。在擬南芥中,ANAC019和ANAC055通過轉錄調控JA誘導的防御基因VSP1和LOX2的表達參與JA介導的防衛(wèi)反應。anac019 anac055雙突變體中VSP1和LOX2的表達水平降低導致植株對B.cinerea的敏感性增強(Bu et al.,2005)。在抵抗病原菌方面,不同植物激素信號途徑之間往往存在著連接和交叉,相互協同或相互拮抗,形成精細而復雜的信號調控網絡。茉莉酸調控寄主對灰霉病菌的抗性也不是一個簡單的線性途徑,而是與其他信號途徑相互作用共同調節(jié)的結果(Devoto and Turner,2005)。在擬南芥中,ERF1基因對灰霉病抗性的調控依賴于茉莉酸和乙烯信號通路(Lorenzo et al.,2003)。ERF1過表達植株中防御響應基因PDF1.2的表達增強,進而提高對灰霉病的抗性(Berrocal-Lobo et al.,2002)。與ERF1一樣,ORA59在茉莉酸/乙烯介導的植物對B.cinerea的防御響應中也起重要作用(Zarei et al.,2011),過表達ORA59可以激活PDF1.2的表達,增強植物對B.cinerea的抗性(Pre et al.,2008)。以上結果表明,ERF1和ORA59是植物抵抗B.cinerea反應中茉莉酸和乙烯信號傳導途徑的交叉點,這也為茉莉酸和乙烯兩種激素相互作用提供了證據。同時水楊酸會通過其信號途徑的下游基因抑制ORA59蛋白的積累,說明水楊酸與茉莉酸/乙烯存在拮抗作用(Van der Does et al.,2013)。WRKY33基因在植物對B.cinerea的防御反應中起正調控的作用。wrky33突變體對B.cinerea感病性增強,這與突變體中水楊酸響應基因PR-1、PR-5和PAD4的強烈表達以及茉莉酸調控基因PDF1.2的表達降低相一致(Zheng et al.,2006),WRKY33可能作為水楊酸和茉莉酸相互拮抗的中間點發(fā)揮作用。此外,脫落酸對植物抗灰霉病的影響與B.cinerea侵染的階段及組織有關,有脫落酸缺陷的sitinen番茄突變體和脫落酸響應因子ABI5的突變體植株均對灰霉病有顯著抗性(Asselbergh et al.,2007)。同時,脫落酸誘導番茄中轉錄因子AIM1正向調節(jié)早期對B.cinerea的防衛(wèi)反應(Abuqamar et al.,2009)。
【相似文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 劉夢雨;CsMYB60對原花青素生物合成及灰霉病相關基因CsWRKY10的調控作用[D];山東農業(yè)大學;2020年

2 李佳林;CsMYB60調控黃瓜類黃酮生物合成的分子機制[D];山東農業(yè)大學;2020年

本文編號：2864345